流式細胞儀結果分析

流式細胞儀分析技術及應用1整理課件流式細胞術(flowcytometry,FCM)是以流式細胞儀為檢測手段的一項能快速、精確的對單個細胞理化特性進行多參數定量分析和分選的新技術。流式細胞術2整理課件流式細胞術最大的特點是能在保持細胞及細胞器或微粒的結構及功能不被破壞的狀態(tài)下，通過熒光探針的協(xié)助，從分子水平上獲取多種信號對細胞進行定量分析或純化分選。

特點：檢測速度快、檢測通量高、單細胞多參數的檢測流式細胞術的特點3整理課件流式細胞儀是測量染色細胞標記物熒光強度的細胞分析儀，是在單個細胞分析和分選根底上開展起來的對細胞的物理或化學性質〔如大小、內部結構、DNA、RNA、蛋白質、抗原等〕進行快速測量并可分類收集的高技術。流式流式細胞儀儀流式細胞儀流式細胞儀流式細胞儀4整理課件樣本來源：各種細胞〔如外周血，骨髓，實體組織、懸浮或貼壁培養(yǎng)的細胞〕，微生物，人工合成微球等。檢測大?。阂话闶?.5um～40um流式細胞儀可以做什么？5整理課件液流系統(tǒng)光學系統(tǒng)數據處理系統(tǒng)

分析型流式細胞儀分選系統(tǒng)分選型流式細胞儀流式細胞儀的組成6整理課件〔1〕液流液流系統(tǒng)流動室流動室〔Flowcell〕是液流系統(tǒng)的核心部件，流動室是由石英玻璃制成，單細胞懸液在流動室里被鞘液流包繞通過流動室內一定孔徑的孔，檢測區(qū)在該孔的中心，細胞在此與激光垂直相交。7整理課件層流水力聚焦技術8整理課件光學系統(tǒng)—LightscatteringatFSCrepresentstheparticlesizeandarea—LightscatteringatSSCdependsongranularityandcomplexityoftheparticle9整理課件激光光源：氣冷式氬離子激光器分色反光鏡：反射長/短波長，通過短/長波長光束成形器：兩十字交叉放置的透鏡透鏡組：形成平行光，除去室內光濾片：長通、短通、帶通光電倍增管：FS,SS〔散射光〕，FL1,FL2,FL3,FL4〔熒光〕光學系統(tǒng)10整理課件FlowTipLaserSSandFLDetectorFSDetector光學系統(tǒng)示意圖11整理課件主要由計算機及其軟件組成〔3〕數據處理系統(tǒng)12整理課件根本工作原理13整理課件單細胞液柱已標記的單細胞懸液和鞘液硅化管流動室噴嘴熒光檢測系統(tǒng)和散射光感受系統(tǒng)收集光信號熒光染料被激發(fā)發(fā)光光電倍增管脈沖信號計算機系統(tǒng)分析結果放大垂直相交形成穩(wěn)態(tài)水平激光與之根本過程14整理課件細胞在液柱中與激光束相交時向周圍360°立體角方向散射的光線信號，它的強弱與細胞的大小、形狀、胞內顆粒折射等有關，主要分為前向散射光和側向散射光。二、散射光的測定15整理課件16整理課件 前向散射光〔forwardscatter,FS〕：激光束照射細胞時，光以相對軸較小角度(0.5°～10°)向前方散射的訊號用于檢測細胞等粒子的外表屬性，信號強弱與細胞體積大小成正比。17整理課件FALSSensorLaser前向散射光示意圖18整理課件 側向散射光〔sidescatter,SS〕：激光束照射細胞時，光以90°角散射的訊號，用于檢測細胞內部結構屬性。19整理課件FALSSensor90LSSensorLaser側向散射光示意圖20整理課件 測得的FS與SS信號通過計算機處理，可得到FS-SS圖，由此可僅用散射光信號對未染色的活細胞進行分析或分選。此為血細胞分類的根本原理，但不能分析外表分子。淋巴細胞單核細胞中性粒細胞光散射測量最有效用途：從非均一群體中鑒別出某些亞群

21整理課件熒光信號由被檢細胞上標記的特異性熒光染料受激發(fā)后產生，發(fā)射的熒光波長與激發(fā)光波長不同。每種熒光染料會產生特定波長的熒光和顏色，通過波長選擇通透性濾片，可將不同波長的散射光和熒光信號區(qū)分開，送入不同的光電倍增管。選擇不同的單抗及染料就可同時測定一個細胞上的多個不同特征。線性放大器和對數放大器三、熒光測量22整理課件熒光染料的特性激發(fā)波長(EXCITING)發(fā)射波長(EMISSION)23整理課件24整理課件熒光補償25整理課件通過流式細胞儀進行細胞分選主要是在對具有某種特征的細胞需進一步培養(yǎng)和研究時進行的。四、細胞分選原理26整理課件細胞懸液形成液流柱流動室振動液流斷裂成液滴空白液滴含細胞的液滴棄去偏轉落入收集器壓電晶體產生機械振動不充電充電〔一〕分選根本原理27整理課件分選速度：單位時間內分選的細胞數量。與懸液中細胞的含量成正比。分選純度：分選出的目的細胞占所有收獲細胞的百分率。分選收獲率：實際收獲的分選細胞與設定通過測量點的分選細胞之間的比率。與純度成反比。分選得率：從一群體細胞懸液中分辨出目的細胞的總量，再經分選后得到目的細胞的實際得率。與分選速度成反比。〔二〕分選的技術要求28整理課件參數：FS,SS,FL數據顯示方式〔單參數直方圖、雙參數散點圖、二維等高圖、假三維等高圖、三參數散點圖〕設門分析技術第二節(jié)數據的顯示與分析29整理課件FS：反映顆粒的大小SS：反映顆粒的內部結構復雜程度FL：反映顆粒被染上的熒光數量多少一、參數30整理課件單參數直方圖雙參數直方圖:點圖 二維等高圖 假三維等高圖三參數直方圖多參數分析直分析方圖設門分析:REGION和GATE設置二、數據顯示方式31整理課件由一維參數(散射光或熒光)與顆粒計數(COUNT)構成，反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數量的多少。〔一〕單參數直方圖32整理課件單參數直方圖細胞相對數量信道(channel)33整理課件雙參數直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測量細胞的兩個測量參數，根據這兩個參數就可以確定細胞在圖上的表達位置。雙參數信號通常采用對數信號，最常用的是點密圖，在圖中，每個點代表一個細胞，點圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數量的多少。〔二〕雙參數直方圖34整理課件1.雙參數直方圖點圖綠色熒光強度紅色熒光強度35整理課件雙參數直方圖點圖36整理課件2.二維等高圖由類似地圖上的等高線組成，其本質也是雙參數直方圖。等高圖上每一條連續(xù)曲線上具有相同的細胞相對或絕對數，即“等高〞。曲線層次越高(越里面的線)所代表的細胞數愈多。等高線越密集那么表示細胞數變化率越大。37整理課件二維等高圖38整理課件3.假三維等高圖39整理課件〔三〕三參數直方圖40整理課件多參數分析：當細胞標記了多色熒光，被激發(fā)光激發(fā)后，得到的熒光信號和散射光信號可根據需要進行組合分析?！菜摹沉魇郊毎麅x的多參數分析41整理課件Gate設置：指在某一張選定參數的直方圖上，根據該圖的細胞群分布選定其中想要分析的特定細胞群，并要求該樣本所有其他參數組合的直方圖只表達這群細胞的分布情況。根據門的形狀又分為了線性門、矩形門、圓形門、多邊形門、任意形狀門和十字門。三、設門分析技術42整理課件A淋巴細胞B單核細胞C中性粒細胞A、B、C均為任意門43整理課件線性門44整理課件Region設置:區(qū)閾〔region,R〕與門(gate,G)是兩個相關的概念，區(qū)閾可與門對應，但是也可以包含于門。45整理課件D1

CD4+/CD3-D2

CD4+/CD3+D3

CD4-/CD3-D4

CD4-/CD3+如十字門分析時，起就可以由四個區(qū)域構成，即G=D1+D2+D3+D4。

46整理課件第四節(jié)流式細胞儀免疫分析的技術要求

樣本制備標記染色液相芯片技術質量控制47整理課件外周血淋巴細胞樣品的制備 別離單個核細胞培養(yǎng)細胞的樣品制備蛋白酶消化機械吹打使貼壁細胞脫落 洗滌尼龍網過濾單細胞懸液一、免疫檢測樣品制備48整理課件新鮮實體組織單細胞懸液的制備機械法酶處理法化學試劑處理法外表活性劑處理法單細胞懸液的保存深低溫保存法〔一年〕乙醇或甲醇保存法〔2周〕甲醛或多聚甲醛保存法〔2月〕49整理課件適用條件:有較高的量子產額和消光系數對488nm的激發(fā)光波長有較強的吸收發(fā)射光波長與激發(fā)光波長間有較大的波長差易與標記單抗結合而不影響抗體的特異性二、常用的熒光染料與標記染色50整理課件FITCTexasredPE.PC.APCPEcy5FL1FL2FL3FL4激光細胞懸液異硫氰酸熒光素得州紅能量傳遞復合染料藻膽蛋白類〔一〕幾種常見的熒光染料51整理課件名稱染料激發(fā)波長熒光顏色溶解性對PH敏感性特點異硫氰酸熒光素FITC488綠525易敏感易溶于水，與抗體結合不影響特異性得州紅Texasred568紅615不易不敏感穩(wěn)定，偶聯后量子產額低藻紅蛋白PE488橙575易不敏感具較多發(fā)光基團，消光系數和量子產額高藻青蛋白PC488別藻青蛋白APC633紅670能量傳遞復合染料PEcy5488紅670易不敏感減少交叉，成本高常用的幾類熒光染料52整理課件 用化學法將兩種不同激發(fā)波長的染料結合在一起，在488nm激發(fā)光照射下，通過一個熒光染料被激發(fā)后產生的發(fā)射波長再激發(fā)另一熒光染料產生熒光信號，從而檢測到該特定熒光信號。能量傳遞復合染料53整理課件PECY5CY5CY5488nm575nm670nm紅色熒光花青苷5藻紅蛋白能量傳遞復合染料機制54整理課件熒光染料與細胞成分的四種結合方式 結構親和式 嵌入結合 共價鍵結合 熒光標記抗體特異性結合免疫熒光標記方法 直標:干擾少,但需購置多種單抗 間標:步驟多,干擾多,不需標記多種抗體 組合標記〔二〕免疫熒光標記55整理課件免疫膠乳顆粒的應用即液相芯片技術是把微小的乳膠微球分別染成上百種不同的熒光色，把針對不同檢測物的乳膠微球混合后再參加待標本，在懸液中與微粒進行特異性地結合，經激光照射后不同待測特產生不同顏色，并可進行定量分析。因檢測速度極快，所以又有“液相芯片〞之稱。三、免疫膠乳顆粒技術的應用56整理課件微小的乳膠微球分別染成上百種不同的熒光色〔固相芯片是用探針在芯片上的坐標位置給基因的特異性編碼；而液相芯片那么是用顏色來編碼〕57整理課件58整理課件通過對標記不同熒光素分子的檢測，實現FCM對可溶性物質的定量分析59整理課件四、流式細胞免疫學技術的質量控制適當的制備方式處理紅細胞實體組織來源標本用機械法溫度25~37℃，pH7.0~7.2〔一〕單細胞懸液制備的質控60整理課件溫度pH染料濃度固定劑〔二〕免疫熒光染色的質控61整理課件光路與流路校正:確保激光光路與樣品流處于正交狀態(tài)，減少變異〔CV〕。PMT〔光電倍增管〕校準:保證樣品檢測時儀器處于最正確靈敏度工作狀態(tài)。絕對計數校準:保證計數的準確性。Flow-checkFlow-setFlow-count〔三〕儀器操作的質控62整理課件同型對照：即免疫熒光標記中的陰性對照，選用相同源性的未標記單抗作為對照調整和設置電壓，以保證特異性。全程質量控制：與待測標本一起標記和檢測，結果達靶值，提示本次實驗結果可靠?！菜摹趁庖邫z測的質控63整理課件第四節(jié)在免疫學檢驗中的應用流式細胞術目前已廣泛地被應用于免疫學根底研究和逐步進入臨床應用各方面，用流式細胞儀對細胞外表的抗原成分進行標記分析，可區(qū)別多種細胞的特性，為細胞免疫的研究增加了有效的手段和幫助。64整理課件T淋巴細胞及其亞群分析

Th(CD3+CD4+CD8-T);Tc(CD3+CD4-CD8+T)B淋巴細胞及其亞群分析

B1(CD19+CD5+):產生IgM型自身抗體,參與免疫調節(jié)、與自身免疫病的發(fā)生有關

B2(CD19+CD5-):受外來抗原刺激,產生高親和性特異性抗體NK細胞分析

NK(CD3-CD16+CD56+)一、淋巴細胞及其亞群的分析65整理課件二、淋巴細胞功能分析細胞介導細胞毒性試驗(死細胞與活細胞比例)細胞內細胞因子測定三、淋巴造血系統(tǒng)及白血病免疫分型對淋巴瘤和白血病進行多色免疫分型用于選擇化療方案、判斷預后及檢出微小殘留病變66整理課件CD4+Th細胞、CD4+/CD8+比例

MDR(+)表示對化療藥物耐藥四、腫瘤耐藥基因分析五、AIDS病檢測中的應用67整理課件HLA-B27可出現在58%～97%的強直性脊椎炎(As)患者 六、自身免疫病相關HLA抗原分析68整理課件七、移植免疫中的應用FCM作為一個強大的技術平臺，已應用于