外標法與工作曲線法測定芍藥苷的量

外標法與工作曲線法測定芍藥苷的量

在制定藥品的物質(zhì)含量時，根據(jù)試驗和測試過程的標準線性方程y.kx-b，確定樣品和對照材料的送樣量，并選擇外部標度法或工作曲線法的定量方法。理論上只有當b=0時用外標一點法定量,當b≠0時用標準曲線法定量,但實際上b≠0,那么在何種情況下可以用外標一點法代替標準曲線法進行定量?本文通過數(shù)學理論推導以及通過測定芍藥苷含量進行驗證,為解決上述問題提供借鑒。1標準直線方程系數(shù)k在進行數(shù)學推導之前,根據(jù)實際情況作以下假設(shè):1.1按工作曲線法標化得直線方程y=kx+b,且x在適當范圍內(nèi)與響應值有良好的線性關(guān)系。1.2選用線性范圍內(nèi)一點(x0,y0)作為外標一點法進行標化得一通過原點直線方程y=y0x0xy=y0x0x,且y0=kx0+b。1.3已知在線性范圍內(nèi)樣品(x1,y1),符合y1=kx1+b,根據(jù)工作曲線法的數(shù)據(jù)點(x12,y1),符合y1=kx12+b,根據(jù)外標一點法得數(shù)據(jù)點(x11,y1),符合y1=y0x0x11y1=y0x0x11。1.5因使用不同外標法引起的相對偏差ε。Δx=|x12-x11|=|y1-bk-x0y0×y1|=|b×(y1-y0)k×y0|ε=Δxx1=|b×(y1-y0)k×y0|x1=|b×(kx1+b-kx0-b)k×(kx0+b)|x1=|b×(x1-x0)(kx0+b)×x1|=|bkx0+b×(1-x0x1)|Δx=|x12?x11|=∣∣y1?bk?x0y0×y1∣∣=∣∣b×(y1?y0)k×y0∣∣ε=Δxx1=∣∣b×(y1?y0)k×y0∣∣x1=∣∣b×(kx1+b?kx0?b)k×(kx0+b)∣∣x1=∣∣b×(x1?x0)(kx0+b)×x1∣∣=∣∣bkx0+b×(1?x0x1)∣∣(公式1-1)由上式可知因選用不同外標法引起的偏差由標準品和樣品的進樣量的比值以及標準品的線性關(guān)系確定。由于高效液相色譜(氣相色譜法)因進樣偏差約為0.5%(5～10μl),1%(1～5μl,自動進樣儀進樣),若注射器進樣偏差也可能略大于1%,因此認為因選用不同外標法所引起的偏差也應可以在1%左右。當選用不同外標法所引起的偏差為1%時,x1x0x1x0和|bkx0+b|∣∣bkx0+b∣∣的關(guān)系參見表1。表1x1x01x1x0和|bkx0+b|∣∣bkx0+b∣∣的關(guān)系表(ε=1.0%)由圖2和表1可得:標準直線方程系數(shù)符合|bkx0+b|≤3.5%∣∣bkx0+b∣∣≤3.5%時,樣品進樣量為對照品進樣量的77%～140%范圍內(nèi),用外標一點法可代替工作曲線法進行定量測定。薄層色譜掃描法進行定量時同板上同一樣品不同點測定結(jié)果偏差可達3%,認為用不同外標法引起的偏差也可達3%。當選用不同外標法所引起的偏差為3%時,x1x0x1x0和|bkx0+b|∣∣bkx0+b∣∣的關(guān)系參見表2。表2x1x02x1x0和|bkx0+b|∣∣bkx0+b∣∣的關(guān)系表(ε=3.0%)由圖2和表2可知:標準直線方程系數(shù)符合|bkx0+b|≤10.5%∣∣bkx0+b∣∣≤10.5%時,樣品進樣量為對照品進樣量的77%～140%范圍內(nèi),用外標一點法可代替工作曲線法進行定量測定。國際人用藥品注冊技術(shù)要求協(xié)調(diào)會在ICH-Q2B方法學驗證工業(yè)指導原則中規(guī)定一般分析含量測定線性范圍應為測試樣品濃度的80%～120%,含量均勻度測定要求線性范圍應為測試樣品濃度的70～130%,至于溶出度測定和雜質(zhì)檢查要根據(jù)具體情況而定線性范圍。因此,認為|bkx0+b|≤3.5%∣∣bkx0+b∣∣≤3.5%(高效液相色譜法或氣相色譜法)或|bkx0+b|≤10.5%∣∣bkx0+b∣∣≤10.5%(薄層色譜掃描法),允許不同外標法引起偏差為不得過1%(高效液相色譜法或氣相色譜法)和3%(薄層色譜掃描法),在一般分析和含量均勻度測定中可用外標一點法代替工作曲線法進行含量測定。2實驗證實2.1vwd-ro系統(tǒng)HP1100系列高效液相色譜儀(自動進樣儀,柱溫箱,VWD檢測器,Chemstation化學工作站)。乙腈(色譜純),重蒸餾水,甲醇(分析純)。芍藥苷(供含量測定用),為中國藥品生物制品檢定所提供。2.2鹽酸測定2.2.1色譜柱及色譜柱流動相:乙腈-0.1%磷酸溶液(11∶89),檢測波長230nm,色譜柱:DiscoveryC18(150mm×4.6mm×5μm)。2.2.2峰面積測定回歸方程精密吸取芍藥對照品溶液(0.04456mg/ml)2,4,6,8,10,12μl,注入液相色譜儀中測定峰面積,根據(jù)最小二乘法計算回歸方程,用前5點計算的回歸方程一為y=1.2901x+8.695,r=0.9997,其中X為進樣量(ng);用6點計算的回歸方程二為y=1.2309x+21.01,r=0.9983。由此可知芍藥苷在進樣量為89.12～445.6ng范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。2.2.3不同外標法引起的偏差的測定選芍藥苷對照品溶液5μl作為外標一點法得一通過原點的直線方程為y=1.3256x,即x0=222.8ng。根據(jù)回歸方程一和直線方程y=1.3256x驗證使用不同外標法引起的偏差ε?bkx0+b=2.94%,結(jié)果參見表3。由上表可知樣品進樣量為對照品進樣量的80%～160%范圍內(nèi),可用外標一點法代替工作曲線法進行定量測定。由上表可知使用不同外標法引起的實測偏差與用公式1-1計算的偏差存在偏差,但不影響最終的結(jié)果。根據(jù)回歸方程二和直線方程y=1.3256x驗證使用不