大鼠離體心臟灌注模型的制備

大鼠離體心臟灌注模型的制備

目前，在心血管保護研究中，常用的離體心臟灌注模型可分為兩種：散動聽模型和離體操作心臟模型，它們不受神經(jīng)液的調(diào)節(jié)，影響因素少，控制好，復制好，因此在心臟生理、病理、生物化學和藥理學方面得到了廣泛應用。本實驗通過制備大鼠離體心臟灌注模型,探討模型制備的方法及注意事項。1材料和方法1.1實驗動物健康成年大鼠20只,雌雄不限。1.2藥物和試劑1.2.1主要設(shè)備離體心臟灌注設(shè)備,美國Powerlab公司。1.2.2試劑的制備1.2.2.試劑、工作液、溶液氯化鈉68.96g,碳酸氫鈉21.17g,氯化鉀3.5g,磷酸二氫鉀1.63g,硫酸鎂1.44g。取試劑置于1L燒杯中,加入等離子水,充分攪拌,加入鹽酸將pH調(diào)至7.40,加水定容至1L,常溫保存。②工作液:取儲備液100ml,加水稀釋至1L;加入葡萄糖1.998g;2mmol/L氯化鈣0.75ml。充分攪拌均勻。1.2.2.氯化鉀/鎂鹽顯色劑生理鹽水400ml,碳酸氫鈉16.5ml,氯化鉀7.5ml,氯化鎂2.5ml,氯化鈣1.32ml,配好以后4℃冰箱冷藏備用。1.3模型準備1.3.1離體心臟灌注取大鼠,稱體質(zhì)量,按1ml/kg給與3%戊巴比妥腹腔注射麻醉。動物充分麻醉后,置于動物臺上并固定。剪開腹部皮膚,沿腹白線開腹,至劍突。提出腸道置于一側(cè),暴露下腔靜脈,經(jīng)下腔靜脈注射肝素生理鹽水3mg/kg。1min后充分肝素化,剪開腹腔血管放血。迅速開胸,剪去胸腺組織,充分暴露心臟及大血管。游離主動脈至無名動脈遠端,并剪斷,迅速剪斷其余大血管,取出心臟,置于4℃K-H液中簡單修剪。開啟離體心臟灌注系統(tǒng),流量約15ml/min。顯微器械提起主動脈,將灌注管道插入,置于主動脈瓣及冠狀動脈開口上方,無創(chuàng)血管夾固定,絲線打結(jié)固定,取下血管夾,開始灌注。心臟搏動逐漸穩(wěn)定,心率約300/min。待心臟穩(wěn)定搏動15min后,關(guān)閉灌注系統(tǒng),心臟逐漸停搏。心肌缺血30min。重新開啟灌注系統(tǒng),心臟迅速恢復搏動,起初心率較慢,搏動不穩(wěn)定,2~3min后逐漸恢復。1.3.2灌注系統(tǒng)調(diào)整取心臟。開啟離體心臟灌注系統(tǒng),流量約15ml/min。顯微器械提起主動脈,將灌注管道插入,置于主動脈瓣及冠狀動脈開口上方,打結(jié)固定,開始灌注,心臟迅速恢復搏動。在肺動脈圓錐處剪一小口,使冠狀動脈流出液自然流出。剪開左心耳,將左心室測壓管經(jīng)切口、左心房、二尖瓣插入,并將另一連于灌注瓶的灌注管插入左心房,打結(jié)固定。連接各測壓管道并調(diào)零,開始測壓。調(diào)整離體心臟灌注系統(tǒng)轉(zhuǎn)速及流量,使主動脈根部壓力約80cmH2O,而灌注瓶與左心房落差約20cm,相當于左心室前負荷為20cmH2O,后負荷為80mmHg。心臟持續(xù)穩(wěn)定搏動。待心臟穩(wěn)定搏動15min后,關(guān)閉灌注系統(tǒng),心臟逐漸停搏。心肌缺血30min。重新開啟灌注系統(tǒng),心臟迅速恢復搏動,起初心率較慢,搏動不穩(wěn)定,2~3min后逐漸恢復。2灌注系統(tǒng)參數(shù)調(diào)整不適宜失敗的情況實驗中共有20只動物用于模型建立,Langendorff模型及離體工作心臟灌注模型各10只。其中主動脈插管失敗1例,灌注系統(tǒng)參數(shù)調(diào)整不合適失敗1例,成功18例(成功率90%)。實驗中心臟均能持續(xù)穩(wěn)定搏動,心臟收縮有力,左室內(nèi)壓為7.1~10.5kPa,處于生理范圍(6.3~10.3kPa),心率250~300/min,心律齊,心臟可平穩(wěn)跳動6h以上。盡管由于一些原因使模型建立失敗率達到10%,但其仍不失為比較符合生理特性的離體心臟灌注模型。3討論3.1離體灌注模型1895年Langendorff首次報道用哺乳動物離體心臟進行心臟機械功能研究;1898年,Porter首先將Langendorff模型用于冠狀動脈循環(huán)的研究,此后各種改良的Langendorff模型廣泛地應用于生理學和藥理學的實驗研究。Langendorff模型的主要方法是采用“主動脈逆行灌注法”,即經(jīng)主動脈插管,Langendorff灌注液通過冠狀動脈系統(tǒng),經(jīng)右心室和肺動脈排出。此模型雖然可給心臟提供營養(yǎng)物質(zhì),使心肌保持跳動,但由于實驗中左心室是空虛的,心臟不能做功,因此心肌保護的實驗研究中多采用離體工作心臟模型。1967年,Neely首次報道離體工作心模型,即在輔助循環(huán)裝置的幫助下,經(jīng)左心房插管,將灌注液經(jīng)二尖瓣流入左心室,在左心室收縮時經(jīng)主動脈排出(主動脈順行灌注法),此時左心室起著壓力-容量交換的作用,并且在心室舒張時使冠狀動脈得到灌注。由于工作心臟模型接近生理上的灌注方式和可靠的測定方法,現(xiàn)已被廣泛地應用于心臟保護的實驗研究中。Langendorff模型操作相對簡單,其本質(zhì)為主動脈逆行灌注,因此相對穩(wěn)定,但心臟做功少,不適合應用于心臟功能的研究。而工作心臟模型雖然操作相對復雜,但是左房順行灌注,更符合生理狀態(tài),而且對心功能變化的敏感性較好。同在體模型相比,Langendorf模型和離體工作心臟灌注模型存在一些優(yōu)點:整體干擾因素比較少,便于觀察心臟在無神經(jīng)體液支配下的自主狀態(tài),許多在體模型無法控制的條件都可以得到很好的控制,模型制備相對簡單,操作方便,適合個體研究者應用。但是這畢竟是在非生理條件下建立起來的灌注系統(tǒng),由于缺乏神經(jīng)體液調(diào)節(jié),使冠狀動脈擴張,而且由于灌注液黏稠度低于血液成分,導致冠狀動脈流量明顯高于在體模型。同時由于灌注液中不含膠體成分,喪失膠體滲透壓,長時間灌注,可引起心肌水腫,從而影響心肌做功。雖然灌注液氧分壓較高,但是其攜帶氧能力較低,這也影響心肌對氧的攝取,使心肌氧供需平衡和缺血再灌注后能量代謝變化與在體模型有一定的差異。本研究中應用離體灌注模型,采用的是非再循環(huán)式的灌注系統(tǒng),避免了代謝產(chǎn)物的堆積,使心肌能在同一基線水平完成各實驗步驟,也簡化了對心功能的各項監(jiān)測。當然也存在一些不足之處,主要是無法精確控制灌注液的容量。3.2開腹經(jīng)下腔靜脈素和并注意使用的措施分析本試驗中模型制備遇到的問題,結(jié)合文獻報道,在制備離體心臟灌注模型時應注意以下事項:①注射肝素的時機。傳統(tǒng)的Langendorff模型建立時要注射肝素抗凝。有文獻報道可不使用抗凝劑,這雖然使操作相對簡單,但如果主動脈插管不順利,易造成冠狀動脈內(nèi)血栓形成,自主心率恢復失敗。本實驗中采用開腹經(jīng)下腔靜脈注射肝素,有效避免了冠狀動脈中血栓形成。②同時本實驗中在全身肝素化之后,取心臟之前,剪開腹腔血管放血,開胸之后視野相對清潔,使操作更為方便,減少了取心臟時心肌缺血時間,同時也有效避免了冠狀動脈血栓形成。③有文獻報道工作心臟灌注液在以上K-H液成分中加入胰島素和牛血清白蛋白(占總濃度