豬肺炎支原體活疫苗免疫刺激復(fù)合物的制備及免疫學(xué)評(píng)價(jià)

豬肺炎支原體活疫苗免疫刺激復(fù)合物的制備及免疫學(xué)評(píng)價(jià)

豬寄生蟲肺炎是由豬感染的寄生蟲引起的。本病已廣泛分布于世界各地，給養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前占市場主導(dǎo)地位的Mhp進(jìn)口滅活疫苗雖然在臨床上顯示出一定效果但并未能達(dá)到令人滿意的保護(hù)程度,其中一個(gè)重要原因可能是體外培養(yǎng)的支原體制備的滅活疫苗缺少了只有在體內(nèi)才能表達(dá)的部分抗原,因此缺乏一部分免疫保護(hù)力。豬支原體肺炎168株活疫苗由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)所研制,而且是目前唯一商品化的豬支原體肺炎活疫苗。目前對(duì)該活疫苗正進(jìn)行免疫途徑的改進(jìn)研究,但經(jīng)肌肉注射途徑免疫可能存在一部分的抗原不能有效表達(dá)的情況;其次是由于活疫苗劑量較小,體液抗體水平不高,在實(shí)際臨床檢測評(píng)價(jià)時(shí)容易因動(dòng)物背景原因而出現(xiàn)波動(dòng),給疫苗使用效果的判定帶來困難。介于以上情況,本研究針對(duì)豬支原體肺炎肌肉注射活疫苗的這兩個(gè)缺點(diǎn)進(jìn)行改善。P97蛋白是目前研究最為深入的Mhp表面的黏附因子,其中的R1區(qū)是直接參與黏附的區(qū)域,也是主要的抗原決定簇。根據(jù)研究報(bào)道目前的滅活疫苗免疫后無法檢測到P97R1抗體,我們的前期研究表明168株活疫苗肌肉注射免疫也無法產(chǎn)生針對(duì)P97R1的有效應(yīng)答。本研究制備含有P97R1的ISCOM-P97R1,并將其作為佐劑加入豬支原體肺炎168株活疫苗肌肉注射免疫小鼠,研究其對(duì)豬支原體肺炎活疫苗的免疫增強(qiáng)作用以及對(duì)P97R1抗原的補(bǔ)充免疫應(yīng)答能力。1材料和方法1.1培養(yǎng)基和試劑膽固醇購自Sigma公司;磷脂酰膽堿、N-癸?；?N-甲基葡糖胺(Mega-10)購自Amersco公司;QuilA購自Accurate公司;支原體KM2培養(yǎng)基由本實(shí)驗(yàn)室制備;辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(HRP-IgG)購自武漢博士德生物工程有限公司;蛋白質(zhì)低相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購自Promega公司;Mhp抗體檢測試劑盒購自美國IDEXX公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司;P97R1由本實(shí)驗(yàn)室提供。1.2豬血清及陰性豬不同免疫及感染背景的臨床豬血清樣品,其中進(jìn)口滅活苗免疫、活疫苗肌肉注射免疫的豬血清及陰性豬血清來自本實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物試驗(yàn)豬,各血清份數(shù)均為7份,自然感染Mhp野毒的豬血清來自某豬場,血清份數(shù)為8份;豬支原體肺炎(168株)活疫苗(批號(hào)20120224)由本實(shí)驗(yàn)室制備;4周齡清潔級(jí)昆明小鼠購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。1.3mhp抗體檢測采集不同免疫及感染背景的豬血清,利用IDEXX試劑盒檢測血清中Mhp抗體水平,同時(shí)用已建立的ELISA方法檢測血清中P97R1抗體的水平。1.4r1的制備和鑒定1.4.1制備：準(zhǔn)備類化合物將磷脂酰膽堿和膽固醇加至20%mega-10中,使溶解完全(終濃度為10mg/mL),分裝,低溫保存?zhèn)溆谩?.4.3檢測bca蛋白表達(dá)水平取10mg/mL的P97R11mL加入非離子活性劑mega-10,使其終濃度為2%,37℃處理12h~18h,使其裂解。加入脂類貯備液0.05mL和QuilA0.45mL,混勻室溫裂解2h。冰浴超聲處理,室溫作用2h,4℃透析72h(PBSpH7.2~7.4,前48h用12000~14000分子量的透析袋,后24h用50000分子量的透析袋)。取10μL采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定ISCOM-P97R1中的蛋白含量,測定操作參照使用說明書進(jìn)行,并采用電鏡檢查。過濾除菌后4℃保存。1.5小鼠肢體肌肉注射給予大鼠的免疫試驗(yàn)選取4周齡小鼠隨機(jī)分成4組,每組10只,分別設(shè)為ISCOM-P97R1+活苗免疫組(含50μgP97R1,活苗量105CCU),ISCOM-P97R1組(含50μgP97R1),活苗組(含活苗量105CCU),陰性對(duì)照組,腿部肌肉注射免疫小鼠,共免疫2次。在免疫后第7d、14d、21d、28d分別對(duì)小鼠進(jìn)行眼球采血,分離血清,-20℃保存?zhèn)溆谩?結(jié)果2.1pul3-mhp抗體的測定采集不同免疫及感染背景的豬血清并檢測其中P97R1抗體水平,結(jié)果顯示:自然感染Mhp野毒的豬血清中Mhp抗體陽性,同時(shí)P97R1抗體水平也呈強(qiáng)陽性;進(jìn)口滅活苗免疫的Mhp抗體陽性,但幾乎檢測不到P97R1抗體;同樣,肌肉注射免疫豬支原體肺炎活疫苗的動(dòng)物Mhp也呈陽性,但P97R1抗體陰性(圖1)。表明P97R1只在自然感染時(shí)大量表達(dá)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性應(yīng)答,當(dāng)滅活疫苗或活疫苗肌肉注射免疫時(shí)均不能有效激活對(duì)P97R1的應(yīng)答,因此缺乏這一部分的保護(hù)能力。2.2iscom-097r1的微觀觀察經(jīng)電鏡觀察,透析法制備的ISCOM-P97R1大小均一,直徑為30nm~40nm,呈典型的蜂窩狀結(jié)構(gòu)的顆粒(圖2)。2.3蛋白包封率的測定透析法制備的ISCOM-P97R1稀釋10倍后的A570值為0.36,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品測定結(jié)果繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出稀釋10倍后的蛋白質(zhì)為0.45mg/mL,即蛋白包封量為8.56mg,計(jì)算出P97R1的包封率為85.6%。2.4sds-頁面分析SDS結(jié)果顯示,所制備的ISCOM-P97R1條帶大小約為29.0ku,與P97R1的電泳帶基本相同(圖3)。2.5豬抗體肺炎活疫刺激活性檢測通過Mhp168株全菌蛋白包被ELISA檢測小鼠血清中的抗體水平顯示,免疫ISCOM-P97R1作為佐劑的豬支原體肺炎168株活疫苗組整體呈高水平抗體,顯著高于無佐劑的豬支原體肺炎168株活疫苗組,表明ISCOM-P97R1對(duì)豬支原體肺炎活疫苗的免疫刺激能力有顯著的增強(qiáng)作用(圖4)。通過P97R1蛋白包被ELISA檢測小鼠血清中的抗體水平顯示,免疫ISCOM-P97R1及免疫ISCOM-P97R1作為佐劑的Mhp168株活疫苗均能顯著誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)的P97R1抗體產(chǎn)生,表明ISCOM-P97R1可以誘導(dǎo)對(duì)P97R1抗原的強(qiáng)烈免疫應(yīng)答。3關(guān)于pahsc1的包封率及免疫效力ISCOM是由皂角素成分QuilA、膽固醇、磷脂以及抗原制備得到的一種納米級(jí)別的具有籠狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。研究表明,當(dāng)QuilA與膽固醇、磷脂及抗原形成ISCOM后,其毒副作用大大降低,并且用量顯著減少,成為極具開發(fā)潛力的免疫佐劑。ISCOM的優(yōu)點(diǎn)在于可以顯著增強(qiáng)細(xì)胞免疫刺激能力。大量研究表明,ISCOM疫苗適用于豚鼠、豬、兔、綿羊、狗、馬、牛等多種動(dòng)物,介導(dǎo)廣泛全面的免疫應(yīng)答,具有較高的免疫原性和安全性。ISCOM常用于包裹重組蛋白及用于重組蛋白疫苗的免疫佐劑。由于制備工藝的不同及各種蛋白本身性質(zhì)的差異,使得蛋白在ISCOM內(nèi)包封率有較大差異。Morein等報(bào)道通過酸化作用或輕微變性作用,使原蛋白的疏水群暴露,可以增加純化蛋白在ISCOMs中的包封率。MhpP97蛋白的R1區(qū)是直接參與黏附的區(qū)域,也是主要的抗原決定簇。國外有多項(xiàng)研究采用P97R1為抗原直接制備重組疫苗獲得攻毒保護(hù),表明P97R1是Mhp重要的致病因子和免疫靶點(diǎn)。因此,我們擬利用P97R1制備免疫刺激復(fù)合物(ISCOM-P97R1),以此為專用佐劑與168株活疫苗配合使用進(jìn)行肌肉注射免疫,以增強(qiáng)活疫苗經(jīng)肌肉注射免疫的免疫刺激能力,同時(shí)通過大量重組P97R1抗原的加入誘導(dǎo)高水平血清抗體實(shí)現(xiàn)對(duì)活疫苗免疫效果的穩(wěn)定監(jiān)測。本研究采用輕微變性的方法處理P97R1蛋白,同時(shí)透析時(shí)先采用小孔徑透析袋(12000~14000分子量),此時(shí)只透析變性劑而蛋白無法透析出去,維持ISCOM形成時(shí)期的蛋白濃度,然后再換用50000分子量的透析袋去除未包裹的蛋白,最終結(jié)果顯示包封率可高達(dá)85.6%。同時(shí)這也與P97蛋白本身為膜蛋白比較容易摻入ISCOM中有關(guān)。同時(shí)研究也證明不含有抗原的免疫刺激復(fù)合物基質(zhì)(ISCOM-基質(zhì))直接與抗原混合也可表現(xiàn)出佐劑活性。目前已開發(fā)為商品化的佐劑ISCOMATRIXTM。本實(shí)驗(yàn)室熊祺琰等嘗試使用ISCOM-基質(zhì)作為豬支原體肺炎活疫苗的佐劑,結(jié)果顯示含佐劑豬支原體肺炎活疫苗肌肉免疫后,可以顯著誘導(dǎo)動(dòng)物對(duì)疫苗抗原的細(xì)胞應(yīng)答,體液應(yīng)答也有一定程度增強(qiáng)。在此基礎(chǔ)上本研究用P97R1制備免疫刺激復(fù)合物ISCOM-P97R1,與活疫苗配合免疫小鼠。結(jié)果顯示在小鼠血清中均檢測到較高的P9