大黃中類成分提取的正交試驗(yàn)法

大黃中類成分提取的正交試驗(yàn)法

大黃是蓼科植物的掌葉大黃。r.檀香山大黃（r.tal.）和醫(yī)用大黃（r.dongot.）的根和根。性寒味苦,具瀉熱毒、破積滯、行瘀血等功效。多用于便秘、譫語發(fā)狂、痢疾初起、血熱吐衄、淤血經(jīng)閉等?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn),大黃具瀉下、抗菌、降血壓、收縮血管、止血、降低血管脆性的作用,而且對小鼠的黑色素瘤、乳腺瘤及艾氏癌腹水型有抑制作用。大黃中的主要成分為蒽醌衍生物,含量約為3%～5%,大部分為葡萄糖結(jié)合甙,游離甙元有大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚等。大黃中蒽醌類成分的提取分離常用方法是酸水解后有機(jī)溶劑提取,但該法存在收率不穩(wěn)定、時間長等缺點(diǎn)。本法改用氯仿提取,可提高收率。1實(shí)驗(yàn)部分1.1藥品、化學(xué)品日本島津CS-9301型薄層掃描儀。大黃素、蘆薈大黃素對照品由中國藥品生物制品檢定所提供;薄層層析用硅膠G(10～40μ,青島海洋化工廠);甲醇、環(huán)己烷、苯、氯仿均為化學(xué)純;大黃(為藥用大黃)購于廣州市藥材公司,由本院生藥教研室鑒定。1.2大黃素、蘆薈大黃素提取正交試驗(yàn)根據(jù)蒽醌類成分提取過程中的幾個主要影響因素,本實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)法對大黃素、蘆薈大黃素的提取過程中,所采用的提取溶劑、提取時間、提取次數(shù)、酸濃度4個因素進(jìn)行考察,選好3個水平,采用L9(43)正交表安排試驗(yàn),見表1。1.3試驗(yàn)方法和結(jié)果1.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線a型定量薄層板按中國藥典方法制備的硅膠G板;以正己烷＿醋酸乙酯＿甲酸(30:10:0.5)為展開劑。在CS-9301型薄層掃描儀上選定大黃素、蘆薈大黃素的λS分別為290nm、342nm;λR分別為342nm、700nm;狹縫0.4mm×10mm;SX=3,CH=1,背景校正:ON;靈敏度Normal;掃描速度Medium。1.3.1.大黃素穩(wěn)定性取大黃素、蘆薈大黃素對照品溶液適量點(diǎn)于硅膠G板上,按上述條件展開,在不同時間在CS-9301型薄層掃描儀上每隔0.5h重復(fù)掃描。結(jié)果表明,大黃素、蘆薈大黃素在5h內(nèi)穩(wěn)定性良好,大黃素的RSD=1.38%(n=10);蘆薈大黃素RSD=1.53%(n=10)。1.3.1.大黃素與蘆薈大黃素的線性關(guān)系分別取大黃素對照品甲醇液(1.0μg/μl)2.0、6.0、10.0、14.0、18.0、36.0μl點(diǎn)于硅膠G板上,分別取蘆薈大黃素對照品甲醇液(0.4μg/μl)2.0、10.0、16.0、18.0、35.0、85.0μl點(diǎn)于硅膠G板上,按前法展開,于CS-9301型薄層掃描儀掃描,得回歸方程分別為:大黃素:蘆薈大黃素:結(jié)果表明,大黃素在0～36μg、蘆薈大黃素在0～35μg范圍內(nèi)含量與峰面積值成良好線性關(guān)系,不過原點(diǎn)。1.3.2樣品回收率測定精密稱取6份相同重量的大黃粗粉,其中5份分別精確加入一定量的大黃素、蘆薈大黃素對照品,以苯為溶劑,加入15%的硫酸,按樣品溶液制備項(xiàng)下投料,提取3次,每次2h,得回收率測定液按1.3.1項(xiàng)方法,用定量毛細(xì)管點(diǎn)樣器分別吸取大黃素、蘆薈大黃素對照品溶液均為5μl、10μl,及各加樣品液5μl,交叉點(diǎn)于同一薄板上,依上述條件展開,掃描測定測得結(jié)果見表1.3.3重量測定1.3.3.硫酸與粗粉、提取溶劑、硫酸投料量比對正交試驗(yàn)的影響分別稱取過20目篩的大黃粗粉9份,每份10g,按L9(43)正交表安排試驗(yàn),大黃粗粉、提取溶劑、硫酸投料量的比為1:5:2,其中硫酸按提取次數(shù)(1、2、3次)分次等量加入。提取完畢將各項(xiàng)下的提取液合并后定容到150ml,即得樣品溶液。1.3.3.實(shí)驗(yàn)方差分析在硅膠G板上分別吸取大黃素、蘆薈大黃素對照品均為5μl、10μl,樣品除7號、9號樣品分別為10μl外,其余均為5μl,點(diǎn)樣,展開,用外標(biāo)二點(diǎn)法(以對照品的點(diǎn)樣量對峰面積作直線,將各樣品的峰面積代入所得直線,即得各樣品的點(diǎn)樣量)掃描測定,結(jié)果見表3。由方差分析(表4)結(jié)果可知,對提取大黃素而言,19.00<FA=19.45<99.00,所以因素A顯著,B、C、D不顯著;由F值大小可知各因素對實(shí)驗(yàn)得率的影響依次為A、C、D、B,由K值大小可知各因素水平應(yīng)為A2B2C3D1,即實(shí)驗(yàn)條件的選擇應(yīng)為以苯為提取溶劑,加入15%的硫酸,提取3次,每次2h。對提取蘆薈大黃素而言,19.00<FA=24.63<99.00,所以因素A顯著,C、D、B不顯著,由F值大小可知各因素的水平選擇應(yīng)為A2B2C3D3;實(shí)驗(yàn)條件的選擇應(yīng)以苯為提取溶劑,加入25%硫酸,提取3次,每次2h。可見,4個因素對大黃素、蘆薈大黃素提取的影響大小是平行的,但水平不一致,由此確定最佳提取條件是以苯為提取溶劑,加入15%的硫酸,提取3次,每次2h。1.4一些分離條件的選擇1.4.1不同萃取用量的蘆薈大黃素提取采用上述確定的最佳提取條件(A2B2C3D1)提取20g大黃粗粉,提取液用pH8緩沖液(枸櫞酸/NaH2PO4配成)分離出大黃酸后,分成a、b兩等份,a液用pH9.9緩沖液(5%Na2CO3:5%NaHCO3為9:1)150ml萃取后,萃取液酸化至pH3得沉淀a1(大黃素粗品);再用pH9.9緩沖液250ml萃取,萃取液酸化至pH3得沉淀a2(蘆薈大黃素粗品);b液5%NaH-CO3150ml萃取后,酸化萃取液至pH3得沉淀b1(大黃素粗品);再用5%Na2CO3250ml萃取,萃取液酸化至pH3得沉淀b2(蘆薈大黃素粗品)。稱取a15.7mg,加入氯仿定容至2ml,配成樣品液;分別稱取a2、b1、b2各15.5mg、10.1mg、12.5mg,加入氯仿定容至5ml,配成樣品液。1.4.2萃取液的選擇對照品溶液及含量測定方法與提取部分同,在硅膠G板上,除b1樣品液點(diǎn)樣量為4μl外,其余樣品均為5μl,對照品均分別為5μl、10μl。展開條件及掃描條件與提取部分同,用外標(biāo)兩點(diǎn)法,進(jìn)行含量測定,結(jié)果見表5。由表5可知,選擇緩沖液為萃取液,結(jié)果較為滿意。從本實(shí)驗(yàn)可看出,大黃中蒽醌類成分提取分離的最佳條件應(yīng)是以苯為溶劑,加入15%的硫酸,提取3次,每次2h,提取液以pH梯度緩沖液為萃取液進(jìn)行分離,得率較高。2黃秋葵、小黃素的提取2.1大黃酸作為大黃中的主要有效成分之一,有較強(qiáng)的生理活性。本實(shí)驗(yàn)所用的大黃,可能受采收季節(jié)、儲藏條件等的影響,導(dǎo)致大黃酸的含量極低,在實(shí)驗(yàn)條件下未能檢出,因而本實(shí)驗(yàn)未進(jìn)行考察。2.2從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出,不同的實(shí)驗(yàn)條件對結(jié)果影響甚大,其中以溶劑對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響最顯著。以苯為提取溶劑,提取大黃中蒽醌類成分的經(jīng)典方法,其收率相當(dāng)高,但苯的毒性較大。在勞動保護(hù)條件較差的條件下,可改成氯仿提取,如本實(shí)驗(yàn)正交實(shí)驗(yàn)法中的結(jié)果所示,亦可得到較令人滿意的結(jié)果。2.3目前,提取大黃素、蘆薈大黃素的酸濃度多采用20%硫酸,據(jù)本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果,采用15%硫酸,其效果更好,且降低成本。2.4在