蝦青素粗提品的提純工藝研究

蝦青素粗提品的提純工藝研究

0蝦青素的生物來源蝦青素是自然界廣泛存在的類胡蘿卜。由于其良好的生物活性和特殊的生理功能，近年來引起了國內(nèi)外研究人員和許多行業(yè)的關(guān)注。蝦青素主要有兩種產(chǎn)品,即人工合成蝦青素和天然蝦青素。目前市場上的蝦青素產(chǎn)品主要是人工合成品,受綠色波的沖擊,其使用不僅為廣大消費(fèi)者警惕,而且也為各國法規(guī)所限制;而從生物體內(nèi)提取的天然蝦青素大多為反式結(jié)構(gòu),使用安全且生物效價高,因此更有發(fā)展前景。目前蝦青素的生物來源主要是:從水產(chǎn)品加工工業(yè)的廢棄物中提取以及用藻類和微生物發(fā)酵生產(chǎn)。就天然蝦青素的生產(chǎn)而言,微藻雖然蝦青素含量很高,但目前離大規(guī)模生產(chǎn)尚有一定距離;用紅發(fā)夫酵母生產(chǎn)蝦青素雖然取得了一定的進(jìn)展,但成本較高。而蝦殼等甲殼類副產(chǎn)品,雖然其蝦青素含量較低,但海島地區(qū)的蝦仁加工業(yè)的下腳料蝦頭蝦殼資源十分豐富,并且可以結(jié)合甲殼素的生產(chǎn)作綜合利用,因此有著巨大的經(jīng)濟(jì)和社會效益。為探索經(jīng)濟(jì)可行的回收蝦青素的方法,提高對甲殼類加工下腳料的綜合利用率和其加工廢水治理的能力,本實(shí)驗(yàn)在甲殼素廢水絮凝物經(jīng)有機(jī)溶劑萃取得蝦青素粗提品的基礎(chǔ)上,對進(jìn)一步提純蝦青素的工藝進(jìn)行了研究。從甲殼素加工廢水絮凝物中提取純化蝦青素?zé)o相關(guān)文獻(xiàn)報道。1材料和方法1.1b分離和高效液相色譜法蝦青素(化學(xué)合成品):瑞士pharmacia公司;固形物(甲殼素加工廢水絮凝回收得到):舟山普陀新興化工廠;甲醇(HPLC級),乙腈(HPLC級),其余試劑均為分析純。可見分光光度計(VIS-7200):北京瑞利分析儀器公司;高效液相色譜儀(LC-10AS);島津公司。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1上層丙酮萃取液的制備稱取10g甲殼素加工廢水絮凝固形物,加蒸餾水2mL。取丙酮15mL,先用稀鹽酸調(diào)其pH=3.0,將其加入固形物中,在55℃水浴中振搖15min,然后4000r/min離心20min,收集上層丙酮萃取液。萃取液經(jīng)真空回收丙酮后得深紅色固狀物及少量油狀物和水,除去水分,加入25mL石油醚溶解,靜置分層,取上層石油醚萃取液,即為蝦青素粗提品。1.2.2分離n2co3用Na2CO3水溶液洗滌去除雜質(zhì)來純化蝦青素粗提品。取石油醚萃取液,定量加入Na2CO3水溶液,保溫振搖洗滌后4000r/min離心5min,分離出醚相和水相。以醚相中的色素保留率和水相中雜質(zhì)質(zhì)量評價去雜工藝條件,從而確定最適Na2CO3濃度、用量、洗滌溫度和時間,并以正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化。1.2.3醚相中色素保留率測定分光光度法:經(jīng)Na2CO3水溶液洗滌并離心分離后的醚相,測定其在474nm處的吸光度,以吸光度來判斷醚相中色素保留率。高效液相色譜法:經(jīng)除雜質(zhì)后的石油醚萃取液在室溫下真空干燥,得蝦青素樣品。選擇標(biāo)準(zhǔn)加入法,以HPLC定性定量分析其游離蝦青素的含量。2結(jié)果與討論2.1不同雜蛋白的最佳提取方法確定由于甲殼加工下腳料中的蝦青素大多與蛋白質(zhì)結(jié)合,以蝦青素脂的形式存在,中性試劑如水和一些鹽溶液可以除去水溶性蛋白質(zhì),而酸和堿都有水解蛋白的作用,使與蛋白質(zhì)結(jié)合的蝦青素釋放出來,進(jìn)入有機(jī)相,水溶性雜蛋白和水解得到的多肽、氨基酸等物質(zhì)則進(jìn)入水相,從而達(dá)到提純蝦青素的目的。選取H2SO4,NH3·H2O,NaOH,Na2CO3,NaCl,H2O等酸、堿和中性的6種試劑,取其水溶液相同濃度0.03g/mL。取6份5mL的石油醚萃取液,分別加入等體積的上述試劑,于室溫下振搖5min后4000r/min離心5min,取上層石油醚相,由于醚相色素濃度很高,稀釋到51倍,在474nm處測其吸光度。差量法測沉淀質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1可以看出,有乳化現(xiàn)象存在,這是因?yàn)槭兔演腿∫褐泻苄噪s蛋白較多,而NH3·H2O堿性較弱引起“O/W”。用NaCl,H2SO4,H2O除雜后的醚相吸光度大,說明色素保留率高,但是去除雜蛋白效果差(無沉淀)。而Na2CO3除雜效果較好,這可能是這些雜蛋白的等電點(diǎn)大于7,水解下來的大分子雜蛋白在堿性溶液里變性沉淀下來。NaOH處理后沉淀量最大,而吸光度小,這是因?yàn)槲r青素在強(qiáng)堿性環(huán)境里不穩(wěn)定,易異構(gòu)化和氧化,損失較大。吸光度和除雜量(沉淀質(zhì)量)較大者為好,因此選擇試劑Na2CO3作為除雜試劑。2.2提取工藝條件的確定2.2.1na2co3對蝦青素活性的影響取8份5mL的石油醚萃取液,分別加入等體積的如表2濃度的Na2CO3水溶液,于室溫下振搖5min,實(shí)驗(yàn)步驟同2.1,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。分三層是上層為石油醚相,中間層為固體沉淀相,下層為水相。從表2可以看出,隨著Na2CO3濃度的增大,分層情況趨向于變好,吸光度趨向于變小。蝦青素化學(xué)結(jié)構(gòu)具有長的不飽和雙鍵,因此容易受光、熱、酸堿、氧化物及酶作用的破壞。從實(shí)驗(yàn)和理論均說明Na2CO3的濃度逐漸增大時,有利于雜蛋白的水解,同時對色素的降解作用也增強(qiáng)。吸光度為色素含量的主要考察指標(biāo),而沉淀則作為參考指標(biāo)。根據(jù)吸光度大小,沉淀量和Na2CO3的用量及分層效果綜合考慮,選擇0.025g/mLNa2CO3為佳。2.2.2co3用量比對3的影響取4份5mL的石油醚萃取液,以石油醚萃取液體積的0.6,0.8,1.0,1.2倍的比例(以下簡稱“用量比”)分別加入0.025g/mLNa2CO3水溶液于室溫下振搖5min,實(shí)驗(yàn)步驟同2.1,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。Na2CO3用量比的大小也關(guān)系到Na2CO3在反應(yīng)中的濃度,原理同2.2.1。在表3中,隨著Na2CO3用量的增大,吸光度基本上保持不變,而沉淀量有從無到有而且增大的趨勢,分層趨向于變好。說明Na2CO3用量的適當(dāng)增大對色素破壞的影響不大,而且有利于游離色素的釋放。由于用量比0.8時吸光度最大,但無沉淀,說明雜蛋白幾乎沒去除,因此由吸光度及沉淀綜合考慮選取用量比1.2。2.2.3洗滌溫度對水相色譜的影響取4份5mL的石油醚萃取液,由用量比1.2加入6mL0.025g/mLNa2CO3,分別在20℃,25℃,30℃,35℃水浴中振搖5min,實(shí)驗(yàn)步驟同2.1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。洗滌溫度對反應(yīng)的影響有兩方面。溫度升高,水解蛋白質(zhì)的反應(yīng)加快,釋放出的游離蝦青素增多,但同時對色素的降解作用也更加明顯,需要找到兩者的最佳結(jié)合點(diǎn)。從表4可以看出,隨著洗滌溫度的升高,吸光度由小變大而后又變小,沉淀量一直在變小,分層均較好,水相有無色到出現(xiàn)紅色的現(xiàn)象。這說明在25℃時釋放出的蝦青素扣除被異構(gòu)化和氧化的已達(dá)到最大值,隨后降解作用超過了釋放作用,同時蛋白質(zhì)水解的也更加徹底,產(chǎn)物多肽和氨基酸進(jìn)入水相,從而使雜蛋白沉淀減少,同時使水相變紅。比較可知,在25℃洗滌時吸光度最大,沉淀量也較多,達(dá)到較好的除雜效果,因此選擇洗滌溫度25℃。2.2.4蝦青素分離萃取實(shí)驗(yàn)取4份5mL的石油醚萃取液,在濃度0.025g/mL,用量比1.2,水浴溫度25℃的基礎(chǔ)上,取洗滌時間分別為3min,6min,9min,12min,實(shí)驗(yàn)步驟同2.1,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。洗滌時間增加主要是讓雜蛋白有充分的時間進(jìn)行水解,從而有利于游離蝦青素的釋放和萃取。從表5可以看出,隨著反應(yīng)時間的增加,分層情況變化不大,吸光度有由小變大而后又變小的趨勢,沉淀量趨向于變小。當(dāng)洗滌時間為6min時,吸光度和沉淀量均最大,說明此時釋放出的蝦青素扣除被異構(gòu)化和氧化的已達(dá)到最大值。時間越長,雜蛋白水解為小分子多肽和氨基酸越完全,因此沉淀量減小。由吸光度、沉淀量大小及耗時等因素綜合考慮取洗滌時間為6min。2.2.5最佳工藝條件的確定在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用L9(34)正交表設(shè)計實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析見表6。表6中,A為Na2CO3濃度;B為用量比;C為洗滌溫度;D為洗滌時間。由表6對吸光度進(jìn)行極差分析,因素主次為A>D>B>C,最優(yōu)方案為A2B3C2D2。對沉淀量進(jìn)行極差分析,因素主次為A>D>B>C,最優(yōu)方案為A2B3C3D2。兩者差別不大。而吸光度是主要考察指標(biāo)。因此,石油醚萃取液用Na2CO3除雜的最佳工藝條件為A2B3C2D2,即Na2CO3溶液濃度0.025g/mL,其用量為石油醚萃取液體積的1.2倍,25℃時振搖6min。因素主次為A>D>B>C,即Na2CO3濃度為主要因素,其次為洗滌時間、用量比和洗滌溫度。2.3標(biāo)準(zhǔn)加入法檢測為了定量的分析蝦青素提純后的純度和提純效果,對蝦青素粗提品和提純品進(jìn)行了HPLC分析。HPLC譜圖見圖1~3。由圖中可以看出,圖2的保留時間為3.290min峰,經(jīng)在蝦青素提純品里加入蝦青素的標(biāo)準(zhǔn)品,即“標(biāo)準(zhǔn)加入法”,得圖3,此時峰高和峰面積明顯增大,而其他峰峰形和保留時間基本不變,說明這個峰正是游離蝦青素峰。由色譜工作站N2000自帶的軟件用面積歸一法分析得其含量為6.94%。與未經(jīng)Na2CO3除雜質(zhì)的蝦青素粗提品的HPLC譜圖1相比較,后者幾乎檢測不到游離的蝦青素,對比效果明顯,純化效果較好。3篩選佳工藝條件以丙酮萃取甲殼素加