DB12∕T 1007-2020 茄果類蔬菜種苗番茄黃化曲葉病毒檢測技術(shù)規(guī)程

65.020.01B

16DB12 12/T

1007—2020茄果類蔬菜種苗番茄黃化曲葉病毒檢測技術(shù)規(guī)程Technical

of

yello

leaf

virus

by

seedsand

seedlings

of

solanu

fruit

天津市市場監(jiān)督管理委員會(huì) 發(fā)

布DB12/T

1007—2020 本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T

1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由天津市農(nóng)業(yè)農(nóng)村委員會(huì)提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：天津市植物保護(hù)研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：王勇、高葦、張春祥、楊利娟、劉曉琳、霍建飛、姚玉榮。.提供下載DB12/T

1007—2020.提供下載1 范圍菌株保存。本標(biāo)準(zhǔn)適用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，茄果類蔬菜種苗番茄黃化曲葉病毒的檢測。2 規(guī)范性引用文件件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修訂版）適用于本文件。GB/T

6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法。3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1番茄黃化曲葉病毒

yeLLo

curl

（TYLCV）虱以持久方式傳播，又被稱為粉虱傳雙生病毒，是一類具有孿生顆粒形態(tài)的植物DNA葉病毒病基本信息參見附錄A。3.2種苗傳播病害 seedling-borne

disease種苗攜帶病原菌進(jìn)行傳播的一類植物病害。4 儀器和試劑4.1儀器1/10000g4.2試劑4.2.1 總體要求除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純?cè)噭?，?shí)驗(yàn)用水符合GB/T

6682。4.2.2 PBS

緩沖液NaCL

8.10

g、24

g、24

1.97

g、蒸餾水1000

，

。.提供下載DB12/T

1007—2020.提供下載4.2.3 商用植物

DNA

提取試劑盒或

DNA

提取試劑DNA提取試劑主要有Lysis緩沖液和乙酸鉀緩沖液。4.2.4 裂解緩沖液100

Tris-HCL

pH

8.0；50

EDTA，pH8.0；1%SDS；10μg/L

RNase

A。4.2.5 乙酸鉀緩沖液乙酸鉀緩沖液3.0，pH5.5。4.2.6 凝膠電泳試劑瓊脂糖，

Buffer，核酸染料GoLdenvie。4.2.7 PCR

aster

ix。5

測試程序5.1 檢測樣品于1萬株，如果該批種苗標(biāo)記或能明顯地看出該批種苗在形態(tài)或文件記錄上有異質(zhì)性的證據(jù)時(shí)，應(yīng)拒絕1020有代表性。5.2檢測方法5.2.1 樣品的制備織物。5.2.2 DNA

的提取病毒DNA的提取可以采用商用植物提取試劑盒或提取試劑，按照提取步驟和方法進(jìn)行，或者采用如下標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行：——從研磨組織物中收集

20g～100g

研磨組織，放置于

1.5L

的離心管內(nèi)（已經(jīng)加入

0.65L

的Lysis

緩沖液），攪拌均勻。每個(gè)離心管震蕩

30s，然后離心

2in（12000rp/in）；——將

0.5L

上清液轉(zhuǎn)入一個(gè)新離心管中，加入

100μL

乙酸鉀緩沖液（3.0，pH5.5）。將離心管反復(fù)倒置幾次充分混勻后，再離心

2in（12000rp/in——取

0.5L

5in（12000rp/in）。去除上清液后加入

0.75L

的

乙醇溶液，振蕩后離心

后去除

3

30in以上，讓樣品干燥后。將

DNA

溶解于

10μL～μL

2O

5.2.3 PCR

檢測步驟.提供下載DB12/T

1007—2020.提供下載對(duì)檢測樣本進(jìn)行PCRB為陽性對(duì)照，采用健康組織為陰性對(duì)照，用滅菌ddH2O為空白對(duì)照，每樣本重復(fù)35.2.4 PCR

產(chǎn)物序列分析對(duì)種苗組織進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目的擴(kuò)增片段為543bp，可對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物雙向測序，與GenBank中TYLCV和GenBank中相關(guān)序列進(jìn)行序列相似性比對(duì)分析，以驗(yàn)證樣品種苗組織研磨物檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。6 結(jié)果判定番茄黃化曲葉病毒的PCR檢驗(yàn)結(jié)果判定的方法見附錄B：——檢驗(yàn)結(jié)果為陰性，可報(bào)告為未檢出番茄黃化曲葉病毒。

PCR

確認(rèn)。7 樣品保存茄果類蔬菜種苗樣品可以其植株、幼嫩組織或DNA的形式保存，該樣品需經(jīng)登記后保存。番茄黃化曲葉病毒的樣品應(yīng)于零下℃保存，保存期為1年。.提供下載DB12/T

1007—2020.提供下載AA附

錄 A（資料性附錄）番茄黃化曲葉病毒番茄黃化曲葉病毒（Toato

YeLLo

Leaf

CurL

Virus）簡稱TYLCV或TY，隸屬雙生病毒科（Geiniviridae）菜豆金色花葉病毒屬（Begoovirus），是一類世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生的單鏈環(huán)狀DNA病毒。TYLCVA.1水量低，果漿酸，部分果實(shí)開裂或表面褐化，失去商品價(jià)值。圖A.1感染

TYLCV

的番茄.提供下載DB12/T

1007—2020.提供下載BB附

錄 B（規(guī)范性附錄）番茄黃化曲葉病毒的

PCR

檢測方法B.1 異性引物檢測番茄黃化曲葉病毒（TYLCV）的特異性引物為：——TYLCV-F：5’-

ACGCATGCCTCTAATCCAGTG

TA-3’；——TYLCV-R：5’-CCAATAAGGCGTAAGCGTGTAGAC-3’。B.2 PCR反應(yīng)體系（25μL）：2x

Taq

asterix

12.5μL，正向和反向引物（10μ1μL，2O

10.5μL，樣品DNA

1μL。B.3 樣品處理分別取1.5μLDNA，進(jìn)行PCR3TYLCV植株組織DNA2O為陰性對(duì)照。B.4 PCR反應(yīng)條件94

℃變性

s，53

℃退火45

s，72

℃延伸1

in，35個(gè)循環(huán)，72

10

；4B.5 PCR結(jié)果判定擴(kuò)增后取2μL

PCR反應(yīng)產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠電泳后，置凝膠成像儀下觀察特異性條帶。TYLCV病毒擴(kuò)增的目的片段長度為543bp（見圖TYLCV反應(yīng)可擴(kuò)增出543bp目的片段，而對(duì)于其他的模板則不能擴(kuò)增