外源no供體對(duì)花楸樹(shù)胚胎萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響

外源no供體對(duì)花楸樹(shù)胚胎萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響

又名花楸樹(shù)，又名花木、山槐、山槐、臭檀木和木蘭。這是薔薇科和蘋(píng)果科。（楊庭輝，2011；2012）。花楸樹(shù)具有較強(qiáng)的耐性,可在冷(云)杉林中弱光下的腐殖土中萌發(fā),同時(shí)它具有很高的觀賞價(jià)值和木材使用價(jià)值。花楸樹(shù)春季滿樹(shù)銀花,夏季羽葉秀麗,秋冬季紅果滿枝,冬季果實(shí)可宿存(Yangetal.,2011)。在一些含有長(zhǎng)壽命樹(shù)種的稠密樹(shù)林中,花楸樹(shù)的遺傳多樣性可能受到威脅?；ㄩ睒?shù)為生長(zhǎng)在小分裂群體中的伴生樹(shù)種,對(duì)高強(qiáng)度的種間競(jìng)爭(zhēng)比較敏感。該樹(shù)種的更新能力較弱,最終可能局部消失(鄭健等,2007;許建偉等,2010)。因此,需要采取有效措施以保存花楸樹(shù)的種質(zhì)資源。目前關(guān)于花楸樹(shù)繁殖研究的報(bào)道以有性繁殖為主,組織培養(yǎng)(楊玲等,2010;Yang等,2012)、扦插(蘇喜廷等,2005)、嫁接(劉瑋等,2006)方面的研究較少。生產(chǎn)實(shí)踐中多以播種育苗的方式繁殖花楸樹(shù)苗木?；ㄩ睒?shù)種子的深休眠特性增加了其播種育苗的難度(沈海龍等,2006;楊玲等,2008a)?；ㄩ睒?shù)種子經(jīng)過(guò)2~5℃低溫層積105天(低溫密封貯藏的種子)至120天(新采收成熟種子)才能萌發(fā)(楊玲等,2008a)。在2~5℃低溫層積過(guò)程中,花楸樹(shù)種皮內(nèi)ABA含量顯著降低,種皮和胚胎內(nèi)各種生長(zhǎng)促進(jìn)物質(zhì)的相對(duì)含量顯著增加(楊玲等,2008b)。將花楸樹(shù)種子用200mg·L-16-BA溶液浸泡2天后在25℃和5℃變溫條件下萌發(fā),可縮短種子萌發(fā)起始時(shí)間,提高種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)(楊玲等,2009)。關(guān)于NO調(diào)節(jié)種子休眠打破和萌發(fā)的研究已有報(bào)道(Bethkeetal.,2004;Gibaetal.,2007;Gniazdowskaetal.,2007)。人們認(rèn)為NO可能是由亞硝酸鹽和硝酸鹽分解產(chǎn)生的(Renataetal.,2006)。已有報(bào)道證明外源含氮化合物處理可以代替植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑促進(jìn)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)。如大麥(Hordeumvulgare)谷粒、擬南芥(Arabidopsisthaliana)種子和一些樹(shù)木種子經(jīng)過(guò)外源含氮化合物處理后,種子生活力和萌發(fā)率均可得到提高(Belignietal.,2000;Bethkeetal.,2004;Gniazdowskaetal.,2010)。更多關(guān)于NO功能的研究來(lái)自NO供體、NO抑制劑和特殊的抑制物的藥理學(xué)研究。最常用到的NO供體是硝普鈉(SNP)。SNP可以促進(jìn)許多植物種子萌發(fā)(Gniazdowskaetal.,2010)。SNP對(duì)光下吸脹的種子萌發(fā)的促進(jìn)效應(yīng)可以被NO抑制劑(PTIO或cPTIO)解除(Bethkeetal.,2004)。Gniazdowska等(2007)認(rèn)為NO打破休眠與乙烯合成的增強(qiáng)相關(guān),即NO作為一種調(diào)控因子通過(guò)調(diào)節(jié)乙烯生物合成解除蘋(píng)果(Malusdomestica)胚休眠。進(jìn)一步的研究表明:NO和氫氰酸(HCN)對(duì)休眠的蘋(píng)果胚萌發(fā)的促進(jìn)效應(yīng)與胚中和萌發(fā)各個(gè)階段中H2O2和超氧陰離子含量的增加相關(guān)(Gniazdowskaetal.,2010)。推測(cè)活性氧和NO在種子萌發(fā)中與傳統(tǒng)的植物激素一起作為第二信使起作用(Gniazdowskaetal.,2010)。本文以我國(guó)東北地區(qū)野生花楸樹(shù)成熟合子胚胎為材料,利用室內(nèi)培養(yǎng)皿發(fā)芽法研究外源NO供體(SNP)、NO合成抑制劑(PTIO)、脫落酸(ABA)以及乙烯受體抑制劑(NBD)對(duì)花楸樹(shù)胚胎萌發(fā)和幼苗發(fā)育初期活性氧(ROS)積累的影響。研究結(jié)果為了解NO在花楸樹(shù)種子休眠解除和幼苗初期發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控作用及其與植物內(nèi)源激素的關(guān)系奠定基礎(chǔ),為生產(chǎn)中改進(jìn)花楸樹(shù)播種育苗方法、提高苗木產(chǎn)量提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1調(diào)查鑒定植物試驗(yàn)材料于2011年9月下旬采自黑龍江省山河屯林業(yè)局鳳凰山林場(chǎng),選取1株生長(zhǎng)良好的野生成年母樹(shù)采集成熟果實(shí),采回后調(diào)制出種子。種子調(diào)制方法同沈海龍等(2006)。1.2方法1.2.1種子吸脹劑試驗(yàn)前選取籽粒飽滿、質(zhì)地均勻的休眠種子(平均千粒質(zhì)量為1.95g,平均含水量為8.39%,平均生活力為99.0%),在20℃±5℃下的蒸餾水中吸脹48h。將吸脹后的種子用0.2%(V/V)NaClO溶液攪拌浸泡10~15min后用清水沖洗干凈。在冰上剝除種皮,用裸胚進(jìn)行試驗(yàn)。1.2.2no-胚胎發(fā)芽效果測(cè)試1體外工作過(guò)程,把snp預(yù)處理的罪犯納入實(shí)驗(yàn),把其萌發(fā)后的不同發(fā)育條件下,所有罪犯通過(guò)不同培養(yǎng)條件確定生存率的標(biāo)準(zhǔn),按照保證參照Gniazdowska等(2010)的方法。在500mL燒杯中放置一張用5mL0.05mol·L-1Hepes-KOH(pH值7.0)充分浸濕的濾紙,上面放90個(gè)剝離的胚胎。然后在同一燒杯里面再放置一個(gè)內(nèi)含5mL5mmol·L-1SNP溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配)的小燒杯,最后用保鮮膜將500mL燒杯的口封好。氣態(tài)NO可以直接從SNP溶液中釋放出來(lái)。胚胎暴露在25℃、光下(光照強(qiáng)度為60μmol·m-2s-1)SNP溶液的蒸汽中3h。處理后,用蒸餾水沖洗胚胎并放置在被蒸餾水浸濕的濾紙上。對(duì)照為不經(jīng)過(guò)SNP預(yù)處理的裸胚。對(duì)照和預(yù)處理的胚胎在直徑9cm的培養(yǎng)皿中(每皿30個(gè)胚)在培養(yǎng)室內(nèi)的光照條件下萌發(fā)。萌發(fā)培養(yǎng)條件同前述預(yù)處理過(guò)程。對(duì)照和處理均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。2snp預(yù)處理胚胎在5mmol·L-1SNP溶液的蒸汽中處理(預(yù)處理過(guò)程同上)3h后,在被3mL300μmol·L-1PTIO溶液浸濕的濾紙上吸脹。對(duì)照胚胎為不經(jīng)過(guò)SNP預(yù)處理,直接在含有3mL300μmol·L-1PTIO溶液的濾紙上吸脹。萌發(fā)培養(yǎng)條件同上。對(duì)照和處理均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。3aba濃度對(duì)催化酶活性的影響胚胎在5mmol·L-1SNP溶液的蒸汽中處理(預(yù)處理過(guò)程同上)3h后,在含有3mL不同濃度ABA(0.1,0.3,1.0,3.0μmol·L-1)溶液浸濕的濾紙上吸脹。對(duì)照胚胎為不經(jīng)過(guò)SNP預(yù)處理,直接在含有上述不同濃度ABA溶液的濾紙上吸脹。萌發(fā)培養(yǎng)條件同上。對(duì)照和處理均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。4體外吸劑預(yù)處理胚胎在5mmol·L-1SNP溶液的蒸汽中處理(預(yù)處理過(guò)程同上)3h后,在含有3mL1mmol·L-1NBD溶液浸濕的濾紙上吸脹。對(duì)照胚胎為不經(jīng)過(guò)SNP預(yù)處理,直接在含有3mL1mmol·L-1NBD溶液的濾紙上吸脹。萌發(fā)培養(yǎng)條件同上。對(duì)照和處理均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。5胚胎萌發(fā)起始時(shí)間每天觀察并記錄。以2片子葉均變綠、胚軸和胚根均伸長(zhǎng)為種子正常萌發(fā)的標(biāo)志。統(tǒng)計(jì)不同處理后的胚胎萌發(fā)起始時(shí)間;萌發(fā)試驗(yàn)第1,2,3,4,5,6,7,8天…,直到萌發(fā)結(jié)束時(shí)的每天的發(fā)芽率和各處理的最終發(fā)芽率。1.2.3體外受精孵化培養(yǎng)試驗(yàn)1:胚胎在5mmol·L-1SNP溶液的蒸汽中處理(預(yù)處理過(guò)程同上)3,27,51,75h后,在含有3mL蒸餾水的濾紙上吸脹。對(duì)照胚胎為不經(jīng)過(guò)SNP預(yù)處理,直接在含有3mL蒸餾水的濾紙上吸脹。萌發(fā)培養(yǎng)方法和條件同上。對(duì)照和處理均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)2:胚胎在5mmol·L-1SNP溶液的蒸汽中處理(預(yù)處理過(guò)程同上)3h后,在含有3mL300μmol·L-1PTIO溶液浸濕的濾紙上吸脹。對(duì)照胚胎為不經(jīng)過(guò)SNP預(yù)處理,直接在含有3mL300μmol·L-1PTIO溶液的濾紙上吸脹。萌發(fā)培養(yǎng)方法和條件同上。對(duì)照和處理均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。分別在試驗(yàn)1和試驗(yàn)2的第8天時(shí)取萌發(fā)形成的幼苗進(jìn)行生理分析。將發(fā)芽測(cè)定結(jié)束后各處理胚胎萌發(fā)形成的葉片與初生根分別剪開(kāi),分成上部葉片(不接觸發(fā)芽床的子葉萌發(fā)形成的葉片)、下部葉片(接觸發(fā)芽床的子葉萌發(fā)形成的葉片)和根(初生根)3部份。然后各部分等量分成3份并稱量,用于下列指標(biāo)的測(cè)定。1鮮質(zhì)量材料總吸光度測(cè)定將約0.05g的葉片用2∶1體積比的丙酮乙醇混合液在25℃下暗中浸提8h,然后用3層濾紙過(guò)濾,測(cè)652nm下濾液的吸光值。結(jié)果用每g鮮質(zhì)量材料在652nm下的吸光度值表示。用U表示一個(gè)OD值,葉綠素含量以U·g-1mL-1作單位。2含量測(cè)定稱取約0.05g的葉片用2mL0.1%(W/V)冷TCA在冰上勻漿。浸提液在4℃下15000g離心15min。取上清液0.5mL,加入0.5mL10mmol·L-1磷酸鉀緩沖液(pH值7.0),在390nm下測(cè)定吸收值。H2O2含量用每g鮮質(zhì)量材料在390nm下的吸光度值表示。用U表示一個(gè)OD值,H2O2含量以U·g-1mL-1作單位。3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作提取材料分別為胚胎萌發(fā)后形成的上部葉片、下部葉片和初生根。提取方法同上。將1.5mL上清液在1mL1mmol·L-1鹽酸羥胺(配制在50mmol·L-1磷酸鉀緩沖液中,pH值7.8)溶液中、25℃暗中孵化30min。取混合液0.5mL,連同0.5mL17mmol·L-1磺胺,0.5mL7mmol·L-1甲萘胺溶液一起在25℃暗中孵化30min。將混合液在14000g離心10min后,在540nm下測(cè)定吸光值。用NaNO2溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,將OD值轉(zhuǎn)換成NO2-1濃度,用U表示一個(gè)NO2-1值,超氧陰離子含量以U·g-1mL-1為單位。1.2.4數(shù)據(jù)處理方法采用Excel2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖,采用DPS(唐啟義等,2002)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行方差分析、Duncan多重比較和相關(guān)性分析。百分?jǐn)?shù)在統(tǒng)計(jì)分析前進(jìn)行反正弦轉(zhuǎn)換。圖表中數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)平均值,“±”之后為標(biāo)準(zhǔn)差。2結(jié)果與分析2.1no限制胚胎發(fā)芽2.1.1no對(duì)花楸樹(shù)胚胎萌發(fā)的影響SNP預(yù)處理對(duì)花楸樹(shù)胚胎萌發(fā)的影響如圖1所示,各處理對(duì)胚胎萌發(fā)影響的差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。萌發(fā)培養(yǎng)的第1天和第2天為子葉張開(kāi)、子葉擴(kuò)展和子葉變綠的過(guò)程。從第3天開(kāi)始,部分胚胎的胚軸開(kāi)始伸長(zhǎng)。隨著萌發(fā)培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),正常萌發(fā)的胚胎比例增加。培養(yǎng)第8天時(shí),SNP+PTIO處理的胚胎萌發(fā)率最高為86.67%(與對(duì)照的萌發(fā)率70.09%差異不顯著),其次是PTIO處理(萌發(fā)率為75.17%,與對(duì)照差異不顯著)。而SNP+H2O處理的胚胎萌發(fā)率最低(為56.67%,與對(duì)照差異不顯著)。從圖1可知,SNP+PTIO組合處理的胚胎萌發(fā)速度較快,在培養(yǎng)的第3天胚胎萌發(fā)率即可達(dá)到51.11%(約達(dá)到最終萌發(fā)率的60%),而其他處理的胚胎萌發(fā)速度與對(duì)照基本一致。SNP+PTIO組合處理的胚胎最終萌發(fā)率分別高于SNP或PTIO單獨(dú)處理的萌發(fā)率。說(shuō)明NO的短期預(yù)處理可以影響花楸樹(shù)的胚胎萌發(fā),過(guò)多的外源NO抑制了胚胎的萌發(fā)。SNP預(yù)處理可以逆轉(zhuǎn)NO清除劑PTIO對(duì)胚胎萌發(fā)的抑制作用。2.1.2aba對(duì)snp培訓(xùn)后胚胎萌發(fā)的影響ABA處理對(duì)花楸樹(shù)胚胎萌發(fā)的影響見(jiàn)圖2。培養(yǎng)第8天時(shí),不同濃度ABA處理對(duì)胚胎萌發(fā)的影響達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。較高濃度的ABA處理抑制花楸樹(shù)的胚胎萌發(fā)。培養(yǎng)第8天時(shí),3.0μmol·L-1ABA處理的胚胎萌發(fā)率最低(為4.00%,與對(duì)照差異極顯著,P<0.01),其次是1.0μmol·L-1ABA(為34.32%,與對(duì)照差異顯著,P<0.05)。0.1μmol·L-1ABA和0.3μmol·L-1ABA處理的胚胎萌發(fā)率分別為63.47%和86.96%(二者與對(duì)照差異不顯著,P>0.05)。SNP與不同濃度(0.1,0.3,1.0,3.0μmol·L-1)ABA組合處理對(duì)花楸樹(shù)胚胎萌發(fā)的影響見(jiàn)圖3。胚胎從第3天開(kāi)始萌發(fā)。培養(yǎng)第8天時(shí),與對(duì)照相比,各處理對(duì)胚胎萌發(fā)的影響差異不顯著(P>0.05)。SNP+0.1μmol·L-1ABA處理的胚胎萌發(fā)率略高于對(duì)照(70.47%),SNP+0.3μmol·L-1ABA,SNP+1.0μmol·L-1ABA,SNP+3.0μmol·L-1ABA處理的胚胎萌發(fā)率略低于對(duì)照(分別為58.38%,57.89%和46.66%)。比較圖2和圖3可知,SNP預(yù)處理削弱ABA對(duì)胚胎萌發(fā)的抑制作用。推測(cè)SNP預(yù)處理可能減小胚胎對(duì)ABA的敏感性,從而削弱ABA對(duì)胚胎萌發(fā)的抑制作用,并且SNP的作用位點(diǎn)可能在ABA作用位點(diǎn)的上游。2.1.3發(fā)影響的差異NBD,SNP與NBD組合處理對(duì)花楸樹(shù)胚胎萌發(fā)的影響見(jiàn)圖4。胚胎從第3天開(kāi)始萌發(fā)。培養(yǎng)第8天時(shí),與對(duì)照相比,各處理對(duì)胚胎萌發(fā)影響的差異不顯著(P>0.05)。NBD單獨(dú)處理、SNP+NBD處理的胚胎萌發(fā)率均低于對(duì)照(分別為45.46%和42.18%)。由圖4可知,NBD處理抑制花楸樹(shù)胚胎萌發(fā),SNP預(yù)處理不能削弱NBD對(duì)胚胎萌發(fā)的抑制作用。說(shuō)明花楸樹(shù)胚胎休眠的解除與乙烯具有密切的相關(guān)性。SNP與NBD組合處理不能提高胚胎發(fā)芽率,推測(cè)是由于SNP的作用位點(diǎn)處于NBD作用位點(diǎn)下游的原因。2.2no對(duì)活性氧ros積累的影響2.2.1no限制睡眠時(shí)維生素含量1葉片葉綠素含量方差分析結(jié)果表明:SNP預(yù)處理對(duì)胚胎上下部葉片的葉綠素含量和總?cè)~綠素含量的影響均達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。多重比較結(jié)果表明:不同SNP處理時(shí)間對(duì)上下部葉片中葉綠素含量和總?cè)~綠素含量的影響均達(dá)到極顯著水平(P<0.01)(表1)。相關(guān)分析結(jié)果表明:上下部葉片中的葉綠素含量呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系(r=0.99),但與SNP處理時(shí)間的負(fù)相關(guān)關(guān)系不顯著(r=-0.26)。各處理中,上下部葉片中葉綠素含量最多的均是SNP處理3h。與對(duì)照相比,SNP處理3h的上部葉片中葉綠素含量增加8.88%,下部葉片中的葉綠素含量增加24.51%。這些差異均達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。說(shuō)明SNP短時(shí)間(3h)預(yù)處理胚胎可以顯著增加幼苗葉片中葉綠素含量。2ptio組合處理前后幼苗葉片葉綠素含量的變化方差分析結(jié)果表明:SNP與PTIO組合處理對(duì)胚胎上、下部葉片的葉綠素含量和葉綠素總含量的影響均達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。各種處理間的多重比較結(jié)果見(jiàn)表2。與SNP單獨(dú)處理相比,SNP與PTIO組合處理對(duì)上部葉片中葉綠素含量影響不顯著(P>0.05),但極顯著增加下部葉片中的葉綠素含量和總?cè)~綠素含量(與對(duì)照的差異也達(dá)到極顯著水平,P<0.01)。與SNP+PTIO組合處理相比,PTIO單獨(dú)處理的胚胎萌發(fā)后其上部葉片中的葉綠素含量顯著增加(21.14%)(P<0.01),但下部葉片中的葉綠素含量則顯著減小(約減小35.01%)(P<0.01),二者的總?cè)~綠素含量差異不顯著(P>0.05)。說(shuō)明SNP預(yù)處理使幼苗葉片中總?cè)~綠素含量增加的效應(yīng)不能被NO清除劑PTIO所削弱。NO清除劑PTIO同樣可以增加幼苗葉片中總?cè)~綠素含量。推測(cè)胚胎萌發(fā)形成幼苗后,葉片中葉綠素含量與NO含量相關(guān)不密切。2.2.2no限制因素對(duì)p22含量的影響1snp處理前后上、下葉片h2含量的相關(guān)性方差分析結(jié)果表明:SNP預(yù)處理對(duì)胚胎上部葉片H2O2含量的影響不顯著(P>0.05),對(duì)下部葉片細(xì)胞中的H2O2含量和總H2O2含量的影響均極顯著(P<0.01)。多重比較結(jié)果見(jiàn)表3。相關(guān)分析結(jié)果表明:上、下部葉片中的H2O2含量不相關(guān),二者與SNP處理時(shí)間的正相關(guān)關(guān)系不顯著(r=0.48)。各處理中,SNP處理75h的上、下部葉片中H2O2含量均為最多。與對(duì)照相比,SNP處理75h的上部葉片中H2O2含量增加0.45%,下部葉片中的H2O2含量增加1260.75%。SNP處理75h的上下部葉片中差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。說(shuō)明SNP預(yù)處理可以顯著引起幼苗葉片中H2O2含量增加。2ptio對(duì)上、下葉片中h2含量的影響方差分析結(jié)果表明:SNP與PTIO組合處理對(duì)胚胎上下部葉片的H2O2含量和總H2O2含量的影響差異不顯著(P>0.05)(表4)。與SNP單獨(dú)處理相比,SNP預(yù)處理后的PTIO處理減少上、下部葉片中H2O2含量,總H2O2含量相應(yīng)減少。與SNP+PTIO組合處理相比,胚胎一直在PTIO中吸脹的處理,使上部葉片細(xì)胞中的H2O2含量增加34.04%,但顯著減小下部葉片中的H2O2含量(約51.94%),總H2O2含量也被減小。說(shuō)明SNP預(yù)處理引起的幼苗葉片中H2O2含量增加可以被NO清除劑PTIO所減少。2.2.3no限制對(duì)超氧陰離子含量的影響1超氧陰離子含量與snp處理時(shí)間的關(guān)系方差分析結(jié)果表明:SNP預(yù)處理對(duì)胚胎上部葉片超氧陰離子含量的影響不顯著(P>0.05),下部葉片及根系中超氧陰離子含量的影響均極顯著(P<0.01),對(duì)總超氧陰離子含量的影響極顯著(P<0.01)。多重比較結(jié)果見(jiàn)表5。相關(guān)分析結(jié)果表明:上、下部葉片、上部葉片與根系中超氧陰離子含量的正相關(guān)關(guān)系顯著(P>0.05),下部葉片與根系中超氧陰離子含量的正相關(guān)關(guān)系極顯著(r=0.94),根系中超氧陰離子含量與SNP處理時(shí)間的負(fù)相關(guān)關(guān)系顯著(r=-0.84),但上、下部葉片中超氧陰離子含量與SNP處理時(shí)間不相關(guān)。各處理中,SNP處理3h的上、下部葉片及根系中超氧陰離子含量均為最多。與對(duì)照相比,SNP處理3h的上部葉片中超氧陰離子含量增加0.41%,下部葉片中的超氧陰離子含量增加19.57%,根系中超氧陰離子含量減少22.26%。說(shuō)明SNP短時(shí)間預(yù)處理可以增加幼苗下部葉片中超氧陰離子含量,隨著處理時(shí)間延長(zhǎng),則使幼苗各部分構(gòu)件中的超氧陰離子含量以及總超氧陰離子含量減少。2．ptio對(duì)下片超氧陰離子含量的影響方差分析結(jié)果表明:SNP與PTIO組合處理對(duì)胚胎上、下部葉片及根系的超氧陰離子含量以及超氧陰離子總含量的影響均不顯著(P>0.05)(表6)。與SNP單獨(dú)處理相比,SNP預(yù)處理后的PTIO處理增加上部葉片及根系中超氧陰離子含量,但使下部葉片中的超氧陰離子含量減少。與SNP+PTIO組合處理相比,胚胎一直在PTIO中吸脹的處理,使上部葉片細(xì)胞中的超氧陰離子含量增加4.01%,下部葉片中的超氧陰離子含量增加21.86%,使根系中的超氧陰離子含量下降34.71%。說(shuō)明PTIO處理可抑制SNP預(yù)處理引起的下部葉片中超氧陰離子含量增加。PTIO對(duì)根部超氧陰離子含量的抑制作用可以被SNP預(yù)處理削弱。3預(yù)處理對(duì)花楸樹(shù)幼苗發(fā)育的影響本研究結(jié)果表明,SNP短時(shí)間預(yù)處理可以影響花楸樹(shù)胚胎萌發(fā)。NO清除劑(PTIO)具有抑制胚胎的萌發(fā)作用,這種抑制效應(yīng)可以被SNP預(yù)處理逆轉(zhuǎn)。研究結(jié)果支持NO能夠影響種子休眠解除的結(jié)論。NO抑制劑的試驗(yàn)說(shuō)明NO是一種種子休眠的內(nèi)源性調(diào)節(jié)閥。NO能夠促進(jìn)許多植物種子的萌發(fā),特別是光敏感種子的萌發(fā)(Gibaetal.,2007)。NO對(duì)植物種子萌發(fā)的作用具有濃度效應(yīng),低濃度的NO對(duì)種子萌發(fā)有促進(jìn)作用,高濃度NO則抑制種子萌發(fā)(Gibaetal.,2007)。本研究中使用5mmol·L-1SNP預(yù)處理3h的試驗(yàn)方法是參考Gniazdowska等(2007)報(bào)道的用于蘋(píng)果胚胎萌發(fā)研究所使用的濃度。在培養(yǎng)第8天時(shí)統(tǒng)計(jì)胚胎萌發(fā)率,結(jié)果發(fā)現(xiàn)SNP+PTIO處理的花楸樹(shù)胚胎萌發(fā)率最高(86.67%,高于對(duì)照),而SNP+H2O處理的胚胎萌發(fā)率最低(56.67%,低于對(duì)照)。說(shuō)明5mmol·L-1SNP預(yù)處理3h對(duì)于花楸樹(shù)裸胚來(lái)說(shuō)處理濃度過(guò)高,因此當(dāng)使用PTIO清除掉多余的NO后,胚胎萌發(fā)率得到提高。這提示在今后進(jìn)一步的研究中應(yīng)該適當(dāng)降低SNP處理濃度或是減少SNP處理時(shí)間。同時(shí),本研究結(jié)果也間接證明了NO對(duì)植物種子萌發(fā)具有濃度效應(yīng)的結(jié)論。較高的ABA含量是維持花楸樹(shù)種子休眠的重要調(diào)控因子(楊玲等,2008b)。花楸樹(shù)新采收并調(diào)制干燥后的種子中含有較高的ABA含量,在2~5℃低溫層積過(guò)程中花楸樹(shù)種皮內(nèi)ABA含量顯著降低(楊玲等,2008b)。本