冷凍電鏡技術(shù)

冷凍電鏡技術(shù)冷凍電鏡技術(shù)第1頁(yè)目錄CONTENTS1冷凍電鏡技術(shù)概述什么是Cryo-EM、冷凍電鏡分類2冷凍電鏡技術(shù)發(fā)展1968—→Now3冷凍電鏡技術(shù)原理樣品冷凍、冷凍成像、三維重構(gòu)4冷凍電鏡技術(shù)應(yīng)用結(jié)構(gòu)生物學(xué)、醫(yī)療、詳細(xì)應(yīng)用場(chǎng)景冷凍電鏡技術(shù)第2頁(yè)P(yáng)ART1冷凍電鏡技術(shù)概述冷凍電鏡技術(shù)第3頁(yè)1

冷凍電鏡技術(shù)概述冷凍電鏡即冷凍電子顯微鏡(cryo-electronmicroscopy，cryo-EM)，是將生物大分子快速冷凍后，在低溫環(huán)境下利用透射電子顯微鏡對(duì)樣品進(jìn)行成像，再經(jīng)圖像處理和重構(gòu)計(jì)算取得樣品三維結(jié)構(gòu)。什么是Cryo-EM冷凍電鏡技術(shù)第4頁(yè)1

冷凍電鏡技術(shù)概述看清楚分子等級(jí)結(jié)構(gòu)必須用電子顯微鏡冷凍電鏡技術(shù)第5頁(yè)1

冷凍電鏡技術(shù)概述理論上電子劑量越高，成像質(zhì)量越好然而生物分子太脆弱，無法承受法承受高劑量電子沖擊冷凍電鏡技術(shù)第6頁(yè)1

冷凍電鏡技術(shù)概述用低劑量電子束配合疊加平均方法解析生物分子結(jié)構(gòu)方法成功拍照但要求分子在樣品中整齊排列，這個(gè)方法普適性比較有限冷凍電鏡技術(shù)第7頁(yè)1

冷凍電鏡技術(shù)概述經(jīng)過給成千上萬個(gè)隨機(jī)朝向同一個(gè)生物分子攝影，得到不一樣角度二維圖像后再利用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行三維重建，得到分子完整三維結(jié)構(gòu)冷凍電鏡技術(shù)第8頁(yè)1

冷凍電鏡技術(shù)概述使生物分子能夠快速冷凍在玻璃態(tài)水中來減輕對(duì)分子破壞電鏡底下觀察能夠得到高分辨率照片冷凍電鏡技術(shù)第9頁(yè)冷凍透射電子顯微鏡（Cryo-TEM）冷凍透射電鏡技術(shù)是在普通透射電鏡上加裝樣品冷凍裝置，將樣品冷卻到液氮溫度(77K),用于觀察蛋白、生物切片等對(duì)溫度敏感樣品一個(gè)技術(shù)。經(jīng)過對(duì)樣品冷凍，能夠降低電子束對(duì)樣品損傷，減小樣品形變，從而得到愈加真實(shí)樣品形貌。冷凍掃描電子顯微鏡（Cryo-SEM）冷凍掃描電鏡技術(shù)普通是在普通掃描電鏡上加裝低溫冷凍傳輸系統(tǒng)和冷凍樣品臺(tái)裝置，它是在掃描電鏡基礎(chǔ)上發(fā)展起來一個(gè)技術(shù)，能夠直接觀察液體、半液體樣品，不需要對(duì)樣品進(jìn)行干燥處理，最大程度地降低了常規(guī)干燥過程對(duì)高度含水樣品影響。冷凍蝕刻電子顯微鏡（Freeze-etching）冷凍蝕刻電鏡技術(shù)是一個(gè)將斷裂和復(fù)型相結(jié)合制備透射電鏡樣品技術(shù)，能夠顯示細(xì)胞、組織微細(xì)結(jié)構(gòu)立體構(gòu)像。它含有使微細(xì)結(jié)構(gòu)靠近于活體狀態(tài)、能夠觀察到不一樣劈裂面微細(xì)結(jié)構(gòu)、能使樣品含有很強(qiáng)立體感且能耐受電子束轟擊和長(zhǎng)久保留等優(yōu)點(diǎn)。冷凍電鏡分類1

冷凍電鏡技術(shù)概述冷凍電鏡技術(shù)第10頁(yè)冷凍蝕刻電子顯微鏡原理是將樣品置于干冰或液氮中進(jìn)行冰凍，用冷刀劈開后，在真空中將溫度回升到-100℃，使斷裂面冰升華，暴露出斷面結(jié)構(gòu)，最終得到能夠觀察復(fù)膜樣品經(jīng)過冷凍，可使其微細(xì)結(jié)構(gòu)靠近于活體狀態(tài)樣品經(jīng)冷凍斷裂蝕刻后，能夠觀察到不一樣劈裂面微細(xì)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而可研究細(xì)胞內(nèi)膜性結(jié)構(gòu)及內(nèi)含物結(jié)構(gòu)冷凍蝕刻樣品，能夠經(jīng)鉑、碳噴鍍而制備復(fù)型膜，含有很強(qiáng)立體感且能耐受電子束轟擊和長(zhǎng)久保留1

冷凍電鏡技術(shù)概述紅細(xì)胞冷凍電鏡蝕刻圖冷凍電鏡技術(shù)第11頁(yè)P(yáng)ART2冷凍電鏡技術(shù)發(fā)展冷凍電鏡技術(shù)第12頁(yè)197419681975AaronKlug開創(chuàng)了基于負(fù)染噬菌體病毒電鏡三維重構(gòu)技術(shù)RobertGlaeser首次提出并進(jìn)行了冷凍含水生物樣品電鏡成像。RichardHenderson利用電子顯微三維重構(gòu)技術(shù)首次取得7埃分辨率細(xì)菌視紫紅質(zhì)3D結(jié)構(gòu)歷史性突破冷凍電鏡技術(shù)發(fā)展21981JoachimFrank完成了單顆粒三維重構(gòu)算法及軟件Spider。1982JacquesDubochet開發(fā)出真正成熟可用快速投入冷凍制樣技術(shù)制作不形成冰晶體玻璃態(tài)冰包埋樣品1990年RichardHenderson利用冷凍電鏡技術(shù)取得了細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白原子水平三維結(jié)構(gòu)模型，第一個(gè)用冷凍電鏡解析出來膜蛋白結(jié)構(gòu)。冷凍電鏡三維重構(gòu)技術(shù)確定蛋白質(zhì)TRPV1結(jié)構(gòu)，標(biāo)志著冷凍電鏡跨入“原子分辨率”時(shí)代冷凍電鏡技術(shù)第13頁(yè)冷凍電鏡技術(shù)發(fā)展21975年，RichardHenderson（理查德·亨德森）利用電子顯微三維重構(gòu)技術(shù)首次取得7埃分辨率細(xì)菌視紫紅質(zhì)3D結(jié)構(gòu)歷史性突破。這是大家首次觀察到膜蛋白跨膜螺旋三維結(jié)構(gòu)。亨德森將未脫離細(xì)胞膜細(xì)菌視紫紅質(zhì)直接放置在電子顯微鏡下進(jìn)行觀察，借助表面覆蓋葡萄糖預(yù)防真空干涸，并采取強(qiáng)度更低電子束流，得出細(xì)菌視紫紅質(zhì)在細(xì)胞膜上是規(guī)整排列且朝向一致。之后，在前述AronKlug等人提出三維重構(gòu)技術(shù)基礎(chǔ)上，亨德森和同事取得了細(xì)菌視紫紅質(zhì)較為粗糙三維立體結(jié)構(gòu)圖像。亨德森所發(fā)展出來方法也含有其不足，這是因?yàn)樗芯康鞍妆旧硖卣髯屟芯空吣軌虿扇∷^“冷凍電子斷層成像術(shù)”來測(cè)定其結(jié)構(gòu)。簡(jiǎn)單來說，研究人員要轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)胞膜，從不一樣角度對(duì)蛋白拍照，最終構(gòu)建出蛋白三維結(jié)構(gòu)。這種方法只適合用于排列有一定規(guī)律蛋白——假如它們是雜亂無章，這種方法就難以奏效了。細(xì)菌視紫紅質(zhì)3D結(jié)構(gòu)冷凍電鏡技術(shù)第14頁(yè)冷凍電鏡技術(shù)發(fā)展21981年，JoachimFrank（約阿希姆·弗蘭克）完成了單顆粒三維重構(gòu)算法及軟件Spider，利用計(jì)算機(jī)識(shí)別圖像把相同蛋白質(zhì)不一樣影子搜集起來，而且將輪廓相同圖像進(jìn)行分類對(duì)比，經(jīng)過分析不一樣重復(fù)模式將圖片擬合成愈加清楚2D圖像。在此基礎(chǔ)上，經(jīng)過數(shù)學(xué)方法，在同一個(gè)蛋白質(zhì)不一樣2D圖像之間建立聯(lián)絡(luò)，以此為基礎(chǔ)擬合出3D結(jié)構(gòu)圖像。單顆粒三維重構(gòu)算法對(duì)于實(shí)現(xiàn)無需結(jié)晶蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)解析至關(guān)主要，弗蘭克圖形擬合程序被認(rèn)為是冷凍電鏡發(fā)展基石。冷凍電鏡單顆粒三維重構(gòu)算法冷凍電鏡技術(shù)第15頁(yè)樣品冷凍技術(shù)在1980年代初，JacquesDubochet（雅克·迪波什）用液態(tài)乙烷代替液氮將含水生物樣品冷卻，成功將水玻璃態(tài)化，（玻璃態(tài)水和冰不一樣，它無固定形狀，不存在晶體結(jié)構(gòu)，與固態(tài)相比，它更像一個(gè)極端黏滯、展現(xiàn)固態(tài)液體，體積不會(huì)像冰一樣膨脹。）在生物樣本周圍以液態(tài)形式固化，使生物分子即使在真空中也能維持天然形態(tài)。1982年，他領(lǐng)導(dǎo)小組開發(fā)出真正成熟可用快速投入冷凍制樣技術(shù)制作不形成冰晶體玻璃態(tài)冰包埋樣品，伴隨冷臺(tái)技術(shù)開發(fā)，冷凍電鏡技術(shù)正式推廣開來。并于1984年用玻璃化方法得到了第一張被水包圍著病毒圖像。時(shí)至今日，冷凍電鏡領(lǐng)域研究者依然應(yīng)用該方法來制備樣品。冷凍電鏡技術(shù)發(fā)展2迪波什1975亨德森用葡萄糖保護(hù)（不能普遍使用）1982迪波什對(duì)生物樣品進(jìn)行玻璃化冷凍電鏡樣品制備問題處理為冷凍電鏡技術(shù)發(fā)展提供了先決條件冷凍電鏡技術(shù)第16頁(yè)冷凍電鏡技術(shù)發(fā)展2原子級(jí)分辨率細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白三維結(jié)構(gòu)模型1990年，亨德森發(fā)表了利用冷凍電鏡技術(shù)取得了細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白原子水平三維結(jié)構(gòu)模型，這是第一個(gè)用冷凍電鏡解析出來膜蛋白結(jié)構(gòu)。他研究證實(shí)了用冷凍電鏡技術(shù)能夠確定分子蛋白近原子分辨率三維結(jié)構(gòu)，被視作冷凍電鏡發(fā)展史上里程碑。冷凍電鏡技術(shù)第17頁(yè)冷凍電鏡技術(shù)發(fā)展2冷凍電鏡跨入“原子分辨率”時(shí)代－

年間，電子直接探測(cè)相機(jī)(electrondirectdetectiondevice，DDD)應(yīng)用，使冷凍電鏡技術(shù)突破了技術(shù)瓶頸，如虎添翼。DDD相機(jī)能夠直接探測(cè)到高能電子，使信噪比和空間分辨率有了飛躍性提升。并在年，研究者們終于取得了理想原子等級(jí)成像，用以制作生物分子三維結(jié)構(gòu)圖像。冷凍電鏡技術(shù)第18頁(yè)冷凍電鏡技術(shù)發(fā)展2年加州大學(xué)舊金山分校（UCSF）程亦凡和DavidJulius研究組首次得到膜蛋白TRPV13.4?近原子等級(jí)高分辨率三維結(jié)構(gòu)（Nature上）。TRPV1蛋白三維結(jié)構(gòu)一個(gè)控制晝夜節(jié)律蛋白質(zhì)復(fù)合體（年諾貝爾生理及醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)）自年確診第一例以來，全球范圍內(nèi)超出150萬人被感染寨卡（Zika）病毒一個(gè)可感知耳中壓力改變、使人聽到聲音蛋白質(zhì)冷凍電鏡發(fā)展就像是一場(chǎng)猛烈革命這項(xiàng)技術(shù)將生物化學(xué)帶入一個(gè)嶄新時(shí)代冷凍電鏡技術(shù)第19頁(yè)冷凍電鏡技術(shù)發(fā)展2TheNobelPrizeinChemistryJacquesDubochetJoachimFrankRichardHenderson

"fordevelopingcryo-electronmicroscopyforthehigh-resolutionstructuredeterminationofbiomoleculesinsolution".冷凍電鏡技術(shù)第20頁(yè)P(yáng)ART3冷凍電鏡技術(shù)原理冷凍電鏡技術(shù)第21頁(yè)3

冷凍電鏡技術(shù)原理

樣品冷凍

冷凍成像

三維重構(gòu)冷凍電鏡技術(shù)第22頁(yè)樣品冷凍目標(biāo)是在低溫下使液態(tài)樣品中水不結(jié)晶而呈玻璃態(tài)，這么既能將樣品在液相狀態(tài)固定，又防止了水結(jié)晶引發(fā)樣品結(jié)構(gòu)破壞。所以，冷凍固定關(guān)鍵是要阻止冰晶形成，冷凍固定是否成功，取決于冷凍過程快速經(jīng)過一個(gè)溫度范圍，即水開始結(jié)晶溫度到開始重結(jié)晶溫度區(qū)間，此區(qū)間受環(huán)境壓力、樣品濃度等原因影響。常壓下純水，從273K開始結(jié)晶，因考慮到過冷水作用，所以從231K開始結(jié)晶，當(dāng)溫度低于重結(jié)晶溫度165K（-108℃）時(shí)，結(jié)晶過程停頓。要使水變?yōu)椴ＡB(tài)，必須急速冷卻到165K。樣品冷凍原理及操作過程3

冷凍電鏡技術(shù)原理冷凍電鏡技術(shù)第23頁(yè)冷凍成像技術(shù)冷凍電鏡成像前冷凍樣品要經(jīng)過專門設(shè)備——冷凍輸送器轉(zhuǎn)移到電鏡樣品室。在成像攝影之前，必須觀察樣品中水是否處于玻璃態(tài)，假如不是則應(yīng)重新制備樣品。冷凍電鏡基礎(chǔ)成像過程大致相同，從電子源發(fā)射高度相干電子束穿透被玻璃態(tài)水包裹樣品，經(jīng)過磁透鏡系統(tǒng)將樣品三維電勢(shì)密度分布函數(shù)沿著電子束傳輸方向投影至與傳輸方向垂直二維平面上。因?yàn)樯飿悠穼?duì)高能電子輻射敏感，攝影時(shí)必須使用最小曝光技術(shù)(minimalexposuretechnic)。要得到高分辨率電鏡圖像，攝影時(shí)累積電子劑量不能超出臨界劑量1000到e/nm-2;中等分辨率電鏡圖像圖像不能超出臨界劑量10000e/nm-2。最小曝光技術(shù)要求首先在低放大倍數(shù)下尋找適當(dāng)區(qū)域;光學(xué)對(duì)位和聚焦應(yīng)在鄰近攝影區(qū)域進(jìn)行。一些原因如：輻射損傷、電子束誘導(dǎo)樣品漂移和放電、電子束不均一等都能引發(fā)圖像質(zhì)量下降。冷凍含水生物樣品因?yàn)闆]有經(jīng)過化學(xué)固定、染色、金屬鍍膜，所取得圖像反差小。冷凍含水樣品電鏡圖像反差取決于樣品本身散射反差、冰厚度和物鏡欠焦量等原因。3

冷凍電鏡技術(shù)原理冷凍電鏡技術(shù)第24頁(yè)3

冷凍電鏡技術(shù)原理三維重構(gòu)技術(shù)-基礎(chǔ)原理該基礎(chǔ)原理基于數(shù)學(xué)中傅立葉變換(Fouriertransform，F(xiàn)T)相關(guān)中央截面定理和傅立葉變換性質(zhì)。中央截面定理可表述為:一個(gè)三維函數(shù)投影函數(shù)傅立葉變換等于該三維函數(shù)傅立葉變換經(jīng)過坐標(biāo)原點(diǎn)，且垂直于投影方向截面函數(shù)。傅立葉變換含有一個(gè)性質(zhì):一個(gè)函數(shù)傅立葉變換逆傅立葉變換，等價(jià)于原來函數(shù)。該原理所包括步驟在數(shù)學(xué)上是復(fù)雜，將這個(gè)原理應(yīng)用于電鏡圖像:一個(gè)三維物體電鏡圖像傅立葉變換等于該三維物體傅立葉變換經(jīng)過物體中心并垂直于攝像方向截面。一個(gè)物體(如蛋白質(zhì)、病毒、細(xì)胞器、細(xì)胞)從不一樣方向所攝取n個(gè)電鏡圖像做傅立葉變換，這些2D傅立葉變換圖像集合組成傅立葉空間，即該物體三維結(jié)構(gòu)三維傅立葉變換，對(duì)此三維傅立葉變換作逆傅立葉變換就恢復(fù)原物體三維結(jié)構(gòu)。這個(gè)原理奠定了電鏡解析物體三維結(jié)構(gòu)基石，全部用電鏡解析物體三維結(jié)構(gòu)方法都是基于這個(gè)原理。因?yàn)檫@一奠基性貢獻(xiàn)，AaronKlug榮獲1982年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。冷凍電鏡技術(shù)第25頁(yè)利用電子顯微鏡對(duì)生物大分子在一維、二維以致三維空間形成高度有序重復(fù)排列結(jié)構(gòu)（晶體）成像或者搜集衍射圖樣，進(jìn)而解析這些生物大分子結(jié)構(gòu)，這種方法稱為電子晶體學(xué)。不過該技術(shù)只有在平面形成一層高度有序排列蛋白質(zhì)分子樣品(在電鏡領(lǐng)域稱為“二維晶體”two-dimensionalcrystal)才能應(yīng)用到冷凍電鏡。伴隨統(tǒng)計(jì)電鏡圖像電鏡硬件和圖像處理/三維重構(gòu)軟件成熟，該技術(shù)在冷凍電鏡技術(shù)領(lǐng)域才會(huì)有更大普適性。3

冷凍電鏡技術(shù)原理三維重構(gòu)技術(shù)-電子晶體學(xué)冷凍電鏡技術(shù)第26頁(yè)利用計(jì)算機(jī)識(shí)別圖像把相同蛋白質(zhì)不一樣影子搜集起來，而且將輪廓相同圖像進(jìn)行分類對(duì)比，經(jīng)過分析不一樣重復(fù)模式將圖片擬合成愈加清楚2D圖像。在此基礎(chǔ)上，經(jīng)過數(shù)學(xué)方法，在同一個(gè)蛋白質(zhì)不一樣2D圖像之間建立聯(lián)絡(luò)，以此為基礎(chǔ)擬合出3D結(jié)構(gòu)圖像。計(jì)算機(jī)能夠依據(jù)細(xì)微差異將圖像自動(dòng)分類，把顆粒分成不一樣集群，每個(gè)集群代表一個(gè)含有特定位置和結(jié)構(gòu)顆粒二維投影。在同一集群里不一樣顆粒被假定為含有足夠相同性，允許進(jìn)入疊加和平均值計(jì)算，使信噪比得以提升。3

冷凍電鏡技術(shù)原理三維重構(gòu)技術(shù)-單顆粒技術(shù)冷凍電鏡技術(shù)第27頁(yè)3

冷凍電鏡技術(shù)原理roofdoorwindows653421顆粒挑選圖像對(duì)齊圖像分類確定方向三維重構(gòu)結(jié)構(gòu)分析三維重構(gòu)技術(shù)-單顆粒技術(shù)簡(jiǎn)單演示冷凍電鏡技術(shù)第28頁(yè)3

冷凍電鏡技術(shù)原理三維重構(gòu)技術(shù)-電子斷層成像技術(shù)經(jīng)過在顯微鏡內(nèi)傾轉(zhuǎn)樣品從而搜集樣品多角度電子顯微圖像并對(duì)這些電子顯微圖像依據(jù)傾轉(zhuǎn)幾何關(guān)系進(jìn)行重構(gòu)方法稱為電子斷層掃描成像技術(shù)。該方法主要應(yīng)用于細(xì)胞及亞細(xì)胞器，以及沒有固定結(jié)構(gòu)生物大分子復(fù)合物（分子量范圍為800kD），最高分辨率約20?。冷凍電鏡技術(shù)第29頁(yè)3

冷凍電鏡技術(shù)原理三維重構(gòu)技術(shù)研究尺度研究對(duì)象研究方法生物大分子二維晶體纖維或管狀晶體電子晶體學(xué)（周期排列）生物大分子復(fù)合體單顆粒生物大分子及復(fù)合體、病毒等單顆粒技術(shù)（全同粒子）亞細(xì)胞水平超分子復(fù)合體、細(xì)胞器、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)電子斷層成像技術(shù)（單一結(jié)構(gòu)）冷凍電鏡技術(shù)第30頁(yè)P(yáng)ART4冷凍電鏡技術(shù)應(yīng)用冷凍電鏡技術(shù)第