紅穿破石藥材hplc指紋圖譜研究

紅穿破石藥材hplc指紋圖譜研究

紅色穿刺石是李科植物的翼果。它主要產(chǎn)于廣西和其他地方。它具有清熱、補水、利尿和通淋的作用，尤其是結(jié)石，對增加收入和尿便、急性腎炎和尿石也有特效藥單。從廣西產(chǎn)紅穿破石根和莖中分離得到大黃素、大黃素甲醚等多種成分,其中大黃素為該植物的主要化學(xué)成分?，F(xiàn)有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究僅有對其大黃素進行定量分析。因此,我們對紅穿破石進行指紋圖譜研究,建立一種能較全面反映其質(zhì)量并對其質(zhì)量進行控制的行之有效的方法。1紅穿破石藥材檢測BUG40超聲波清洗器(上海必能信公司);Waterse2695,Agilent1100高效液相色譜儀。紅穿破石藥材由廣西玉林制藥有限責(zé)任公司提供,經(jīng)玉林制藥有限責(zé)任公司質(zhì)量部鑒定為正品;大黃素對照品由中國藥品生物制品檢定所提供(批號110756-200110)。甲醇為色譜純,水為超純水,其他試劑均為分析純。2方法和結(jié)果2.1提取的色度條件和方法的確定2.1.1樣品處理方法的確定根據(jù)紅穿破石中所含主要成分,供試品溶液提取方法的考察比較了采用甲醇超聲處理和甲醇加熱回流不同提取時間的提取效果,結(jié)果指紋圖譜相似,而以超聲提取20min及回流提取30min以上峰強度最大,因此,樣品的處理選用相對簡便的超聲提取20min。2.1.2吸收波長的考察采用PAD檢測器進行全波長檢測,并結(jié)合大黃素的最大吸收波長進行考察。在254、291nm波長下的HPLC圖譜中均有相同數(shù)目的色譜峰。291nm波長下,峰強度較大,因此選定291nm作為檢測波長。2.1.3色譜柱分離和分析選擇了3種不同填料的色譜柱:AgilentTC-C18、LichrospherC18、KromasilC18,結(jié)果3種色譜柱分離大黃素及其他指紋峰均有較好的峰型和穩(wěn)定性,且三者的色譜圖基本一致,在紅穿破石分析中可通用。2.1.4洗脫系統(tǒng)選擇分別比較了甲醇-0.1%磷酸溶液的不同梯度洗脫效果,結(jié)果以“2.2.1”項下梯度系統(tǒng)分離度較好,所有峰均基本達(dá)到基線分離,故選擇其作為洗脫系統(tǒng)。2.2紅透破石譜研究2.2.1樣品系統(tǒng)及運行時間用十八烷基鍵合硅膠為填充劑(AgilentTC-C18柱,250mm×4.6mm,5μm),柱溫35℃,甲醇(A)-0.1%磷酸溶液(B)系統(tǒng),按表1梯度洗脫,流速1.0ml/min,運行時間60min,檢測波長291nm,進樣量10μL。2.2.2超聲處理法取紅穿破石中粉0.2g,精密稱定,精密加入甲醇20mL,稱定重量,超聲處理(50Hz,250W)20min,放冷,用甲醇補足減失的重量,搖勻,經(jīng)0.45μm濾膜濾過,即得。2.2.3對照溶液的制備2.2.4色譜圖的測定精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10μL,注入液相色譜儀,記錄60min的色譜圖,結(jié)果見圖1、圖2。以圖2與圖1進行比較,在樣品圖中的大黃素色譜峰(12號峰)能得到較好的指認(rèn),因此在相似度軟件計算中,均以此峰作為參照色譜峰,有助于紅穿破石指紋圖譜色譜峰的指認(rèn)。2.2.5紅透破石涂料的指紋圖2.3指紋圖的方法研究2.3.1指紋圖譜檢測非共有峰面積的分析以保留時間約為38.9min的12號色譜峰作為參照峰,對10批藥材的指紋圖譜進行考察,確定了13個共有峰。并對各峰的相對保留時間及相對峰面積進行了計算,統(tǒng)計各批樣品非共有峰與總峰面積的百分比,其結(jié)果為非共有峰面積百分比在1.25%~3.31%之間,符合《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)》中“非共有峰總面積不得大于總峰面積的10%”的檢測要求。具體數(shù)據(jù)見表2、表3。以紅穿破石主要產(chǎn)地廣西所產(chǎn)藥材為重點研究品種,于廣西區(qū)內(nèi)共收集7批藥材,其他地區(qū)藥材3批,按文中的方法進行色譜分析。將10批藥材的色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》2O04年A版相似度軟件,考察色譜峰相似度的一致性,進行相似度的評價。具體數(shù)據(jù)見表4。2.3.2儀器精密度試驗精密吸取同一供試品溶液10μL,注入色譜儀,重復(fù)進樣5次?？啥康纳V峰有19個,其中的13個色譜峰重復(fù)性好,其相對保留時間及相對峰面積的RSD均小于5%,13個峰占總峰面積的95%以上,表明儀器精密度良好。2.3.3溶液穩(wěn)定性測定取同一供試品溶液,分別在0、4、8、12、23h測定,結(jié)果各峰相對峰面積RSD<5%,相對保留時間RSD<5%,表明供試品溶液在23h內(nèi)基本穩(wěn)定。2.3.4重復(fù)試驗3紅穿破石藥材成分的初步篩選本試驗通過對紅穿破石藥材提取方法等因素的考察,確定了試品溶液的制備方法,考察了檢測波長、色譜柱、流動相不同梯度對樣品色譜行為的影響,優(yōu)選了分離紅穿破石藥材的色譜條件;同時,紅穿破石中的有效成分大黃素,其在指紋圖譜中的保留時間適中,含量較高且穩(wěn)定,故以其作為參照峰建立了紅穿破石藥材的指紋圖譜。利用“相似度軟件”考察了不同產(chǎn)地10批次紅穿破石的相似性。結(jié)果表明,該方法操作簡便,專屬性強,重復(fù)性好,能較好地體現(xiàn)紅穿破石藥材成分的整體性。取大黃素對照品適量,精密稱