天然蒽醌化合物對植物病原真菌生物活性及作用機(jī)理研究

開發(fā)生物活性高、對非靶標(biāo)生物安全、環(huán)境相容性好的生物合理農(nóng)藥目前已成為農(nóng)藥發(fā)展的新趨勢，本研究從植物中尋找高活性的天然產(chǎn)物，并研究其相關(guān)特性，以期為新農(nóng)藥的開發(fā)應(yīng)用提供依田問試開發(fā)生物活性高、對非靶標(biāo)生物安全、環(huán)境相容性好的生物合理農(nóng)藥目前已成為農(nóng)藥發(fā)展的新趨勢，本研究從植物中尋找高活性的天然產(chǎn)物，并研究其相關(guān)特性，以期為新農(nóng)藥的開發(fā)應(yīng)用提供依田問試驗結(jié)果表明，藥用大黃的乙醇提取物，對黃瓜白粉病和番茄灰霉病菌具有良好的防效果．其稀釋IOO倍和250倍的防效分別與對照藥劑15．,4--唑酮可濕性粉劑稀釋1000倍防治采用活性追蹤和色譜法分離純化植物大黃和巴天酸模中的活性化合物，利用現(xiàn)代波譜技術(shù)進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定，確定為大黃酚、大黃素甲醚、大黃素、大黃素．1，6．二甲醚和大黃酸。蒽醌衍生物在對植物提取物對病原真菌的活性中起主導(dǎo)作用，7個蒽醌衍生物的抑菌譜測定結(jié)果表明，在1物活性，明顯優(yōu)于極性較高的蒽醌衍生物(含羥基較多或羧基)大黃酸、大黃素、l，8．二羥基蒽藥用大黃提取物中的蒽醌化合物大黃素甲醚對白粉菌的活性優(yōu)于大黃酚，化合物之問對植病原菌的活性存在增效作用。對于小麥自粉病菌，丈黃素甲醚和大黃酚組合物的增效比率R值(理論EC√觀察EC∞)為O．99-2．78．對于黃瓜白粉病菌，大黃素甲醚和大黃酚組合物的增效比率為1．Ol~4．06。大黃索甲醚和大黃酚在組合物中的比率為6：4--9：l時，對小麥白粉鹵和黃瓜白粉菌的活性表現(xiàn)為加性效應(yīng)。比率為I：9巧：5時，表現(xiàn)為增效作用，增效水平隨著大黃酚在組合物中的比率的增高而升高。當(dāng)天然產(chǎn)物直接用作生物i!ii農(nóng)藥時，活性成分的種類和比率都需要確定以保證防效的穩(wěn)定性2004～20059個地區(qū)262個向粉病菌株的Ec”值的分布成正態(tài)分布，ECso值的變異范圍為0．153-．-mLl，平均值0．304嶇mL"1為敏感基線。116個霜霉病菌株的ECho值的分布成正態(tài)分布，Ec”值的變異范圍為0．280．,-0．748lagmL"‘，平均值0．501lagmL"1甲醚選擇壓力下，Gi,．．．4315的EC50值變化范圍為0．249,．0．395lagmUl，與初始GO的EC”值0．301峙mL"成的附著胞大部分為畸形，不能形成吸器原體；接種后8h噴旖大黃素甲醚的畸形附著胞比率清水處理的5,-．6倍，能減少約90％的吸器原體形成比率：接種后24sh2甲醚，仍能不同程度抑制初生吸器和菌落的迸一步生長發(fā)育。并減少單菌落形成吸器的個數(shù)，從而最終減少葉段上病斑數(shù)。大黃素甲醚對小麥白粉病菌生長發(fā)育的各個階段均有一定作用，最顯著的作用發(fā)生在入侵之前，即吸器原體形成前的階段。大黃素甲醚對小麥白粉病菌和黃瓜灰霉病菌在離體條件下沒有直接的抗菌活性，但在活體條件下活性很高。挑戰(zhàn)接種試驗結(jié)果表明該化合物局部誘導(dǎo)了植物對病原菌的抗病性toenvironmentsisbeingpaidattentiondevelopbiopesficldeswithsafetoIIOOtalgetsintheworld．他thesisevaluatedbioactivitiesandactionmechanismoffrom見鋤spp．a(chǎn)gailIstplantcompoundon幢assessmentoffieldcontrolindicatedthattheethanolexlfactoffrom足。疥cucmberpowderymildewandtomatogreyhighefficacyonefficacyoftheplantthatoftriadimefon15％WP越1000fold250agahmequalcucumberpowdorymildew,andthatofpyrimethaniltoenvironmentsisbeingpaidattentiondevelopbiopesficldeswithsafetoIIOOtalgetsintheworld．他thesisevaluatedbioactivitiesandactionmechanismoffrom見鋤spp．a(chǎn)gailIstplantcompoundon幢assessmentoffieldcontrolindicatedthattheethanolexlfactoffrom足。疥cucmberpowderymildewandtomatogreyhighefficacyonefficacyoftheplantthatoftriadimefon15％WP越1000fold250agahmequalcucumberpowdorymildew,andthatofpyrimethanil70％WGdilutedat1000andrbeintheirchemical蚰u咖isolatedanthraquinones—1,6-dim劇hyl-cmodin．emodin,rhein,alizarinand1,8-dihydrogen-anthraquimmew啪usedtoschrysophanoland1,6-dimethyl-emodinlipophilicityhadhighbioactivitiesOngrammisandMaganaporthegrisea,bIlt／nvitrottIeydidnotnearlyinhibitthehyphalcinerea．Sclerotiniaro必ii,Physalospora l，8-dihydrogen-anthraquinonewith8．gramini镕andMg啦eo。weakerbioactivities／nvivoExperimentswereconductedinlaboratoryand掣胃mhou辯todeterminetheinteractionwasmildewandmildews．TherebioactivechrysophanolathetwoOildiseases ratiosofinteractionfroml19toincreasedwiththechrysophanolsynergisticinthecombination．Thefindingindicatesthatinordertoensuiechrysophanoleffie∞yoftheethanolextractofrheumrOOtSOildiseases,boththeactiveingredientsphyscionandchrysophanolhavetobeendtheproportionTopmvidebasicdatafortheriskassessmentoffungicidalresistanceforthiskindofplamann髟fortheestablishmentofsensitivitybaselinesselectedphyscionpowderypopulationsbasedOilisolatesofS．fuligineafrom9他giom，andl16isolatesofP．cubensisfrom6regionsjnChinaduring2004—populationsbasedmildewisolateWaSmonitoredforfifteensensitivityofunderresultsshowedthattherewaspressureofforeitherregiO邶distributionoftomildewisolatesormildewⅡnornudunhnoddcl撇whhmcllllECs00．304PgmrlforpowdaymildewpopulationandIl伽IECThevariationsofnornudunhnoddcl撇whhmcllllECs00．304PgmrlforpowdaymildewpopulationandIl伽IECThevariationsofsensitivitytophyscionwflresmall0．501 fordownymildewthefactorsvariedfrom1．63to3．42艇_dfrom1．70to2．38amongpowdoIyanddownyisolatexz4didpopulagons,respectively．TheattheofEC_’eforWhenphyscionwasappliedinoculation,thegerminationofconidiaWaSinhibitedandap畔 rateafterinoculationn磚thepfimaryh鋤ls幻riawasreducedand曲峙numberofcolonyasignificantlyinhibitthegerminationPhysciondidnotinhibitthegerminationofconidia加conidia由，v／vo．a(chǎn)ndchallenge- showedthatphyscioninducedtheratherthanthesystemicresistanceofhostplantsagainst獨創(chuàng)性聲本人聲明所呈交的論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研獨創(chuàng)性聲本人聲明所呈交的論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得確的說明并表示了謝意聊時間關(guān)于論文使用授權(quán)的說研究生魏枷r俐20世紀(jì)s¨0年代20世紀(jì)s¨0年代，國內(nèi)外許多專家認(rèn)為，化學(xué)農(nóng)藥的使用將走到盡頭。逐步取而代的將是生物防治、物理防治和綜合防治等(Heinrichs＆Mchida1984，Pngali＆Goger1995，屠予欽＆袁會珠1996)．但事實表明，在可預(yù)見的歷史時期內(nèi)，農(nóng)藥和化學(xué)防治法仍將無法完全被取代，開發(fā)生物活性高，對非靶標(biāo)生物安全、環(huán)境相容性好的生物合理農(nóng)藥目前已成為農(nóng)藥發(fā)展的新趨勢(馬志卿d以2000)。目前我國小麥、水稻，玉米和棉花的種植面積約93337J-hm2，蔬菜、煙葉種植面積約3萬hm2；糧棉田年用殺蟲剩30萬t以上，蔬菜田年用殺蟲裁8萬t以上，因此，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)對農(nóng)藥的藹求量很大(曹雅忠甜烈植物源農(nóng)藥作為生物合理農(nóng)藥的一部分，以其低毒、選擇性高、易降解等獨特優(yōu)勢迎來了新的發(fā)展機(jī)遇。據(jù)報道在中國有100種重要的作物有害生物，其中約720種是病原物，占近45％(Go2004)，殺菌幫的研究開發(fā)任重道遠(yuǎn)，加強(qiáng)新型天然植物源殺菌劑的研制，是防治植物病害的重要途徑之一．用于植物源殺菌劑的植物資源植物產(chǎn)生次生代謝物抵御病蟲害的侵?jǐn)_是植物與有害生物相互適應(yīng)，演變、協(xié)同進(jìn)化的結(jié)果(馬怎卿eta1．2002)。地球植物資源豐富，其產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物超過40萬種(李永剛da1．2002)，種類繁多的植物次生代謝產(chǎn)物是開發(fā)植物源殺蟲、殺菌劑的物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，植物源殺菌劑研究開發(fā)的空間相當(dāng)寬闊。與傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥相比，植物源農(nóng)藥有其自身獨特之處。①環(huán)境相容性好。植物源農(nóng)藥在自然界有其順暢的降解途徑，對環(huán)境污染小。②生物活性多樣。植物源農(nóng)藥不僅具有殺蟲活性，還兼有殺菌和調(diào)節(jié)植物生長的作用，且作用方式多樣．③對高等動物及害蟲天敵安全．大多數(shù)植物源農(nóng)藥觸殺作用不強(qiáng)，對害蟲天敵影響很?。苡泻ι锊灰桩a(chǎn)生抗藥性．植物源農(nóng)藥往往含有數(shù)種有效成分，且作用機(jī)制與一般化學(xué)農(nóng)藥不同，不易使有害生物產(chǎn)生抗藥性．⑤對農(nóng)作物安全，而且有的植物源農(nóng)藥有利于作物生長(劉長令&李正明2003，徐漢虹2001，江紹玫2000，1997)．國外直接利用植物源農(nóng)藥主要發(fā)生在19世紀(jì)，從目前的資料查詢，國外已經(jīng)登記的有巴堿(Coppingetal．1998)，而市場上銷售的品種有30余種(高菊芬2001)．我國目經(jīng)登記的植物源有效成分目前有16-18種，由此而延伸的鑭劑有100余種。我國已經(jīng)登記的效成分包括；煙堿、魚藤酮、藜蘆堿、茶皂素、川楝素、印楝素、蔭蒿素、百部堿、苦皮藤素、苦參堿、松脂合劑、馬錢子堿、異羊角扭甙、烏頭堿、茛菪烷堿、蕓苔素內(nèi)醋、蓖麻、油酸、骨酯素；正在研究和登記的有效成分有：砂地柏、蛻皮素A、毛茛堿、螟蛻素、2．蒎烯、蛻皮酮、香茅油、雷公滕堿、銀杏黃酮甙、夾竹桃甙、牛兒酵、莰酮等(史衛(wèi)國et矗1997，徐漢虹2001)。參堿、煙堿、雷公藤堿、百部堿、馬錢子堿、莨菪堿，血根堿，小檗堿、苦豆子堿、藜蘆堿、辣椒堿、博落回堿、蘆竹堿、烏頭堿等。②藉烯類：如印撩素、川探素、苦楝、苦皮藤素、苦皮藤醋、鬧羊花素Ⅲ、雷公藤甲素等．③黃酮類：如魚藤酮、毛魚藤酮等。④精油類：如桉樹油、薄荷油、菊蒿油、茼蒿油、蕓香精油、肉桂精油、豬毛蒿油、丁豆油等．⑤光活化毒素：如7·苯基-2,4。傾三炔、茵陳二炔、金絲桃參堿、煙堿、雷公藤堿、百部堿、馬錢子堿、莨菪堿，血根堿，小檗堿、苦豆子堿、藜蘆堿、辣椒堿、博落回堿、蘆竹堿、烏頭堿等。②藉烯類：如印撩素、川探素、苦楝、苦皮藤素、苦皮藤醋、鬧羊花素Ⅲ、雷公藤甲素等．③黃酮類：如魚藤酮、毛魚藤酮等。④精油類：如桉樹油、薄荷油、菊蒿油、茼蒿油、蕓香精油、肉桂精油、豬毛蒿油、丁豆油等．⑤光活化毒素：如7·苯基-2,4。傾三炔、茵陳二炔、金絲桃素、香豆素類等．@番茄枝內(nèi)酯：由35-39個碳原子構(gòu)成殺蟲劑魚藤酮及有機(jī)磷殺蟲劑乙酰甲胺磷高得多。⑦其他；羧酸醋類，如除蟲菊醣：木脂索類，200l，a／．202，操海群etLeta／2004)．天然蒽醌衍生物在植物體中廣泛存在，許多已經(jīng)是傳統(tǒng)中草藥的活性成分，用于人類抑菌、ea．197，Cangt／．196199，濤eta1．2000)。天然蒽醌衍生物對植物病原真菌的活性的報道并不多見，更無系統(tǒng)的報$CChoi物界只有蚊科節(jié)肢動物及海百合綱的海洋動物中被發(fā)現(xiàn)。天然總醌分為大黃素型和茜素型中藥如大黃，決明子、虎杖等中都有含這種結(jié)構(gòu)類型蒽醌。大黃素是分布最廣泛的一種葸醌化物，從許多霉菌、地衣、高等植物及昆蟲均有發(fā)現(xiàn)．圖I．1列出了五種大黃素型羥墓蕙醌。舉喁毋OpOH鋤鼬DOil勢O哂舉Oa圖1．1晦1-Thechemicalstructureaoffive2藥中。主要的茜草型葸醌結(jié)構(gòu)見圖n_岫^K痂P舅u圖l-2sir．．1-2Thechemicalstructuresofthree藥中。主要的茜草型葸醌結(jié)構(gòu)見圖n_岫^K痂P舅u圖l-2sir．．1-2Thechemicalstructuresofthree迄今為止，還發(fā)現(xiàn)了一些特殊的蒽醌類化合物et以1999)．如藤黃科植物madaysim中含有異戊烯醚基團(tuán)；鼠李科植物的嘲觚砌w含有p，}二甲基取代科植物的中有乙烯基取代基：曲霉中aversht有歧鏈的四碳取代基等；此外還有芳烴取代的化合物如紫膠蟲分泌的紫膠中蟲漆酸甲acid)；白合科植物的knipholone。Sekar從Cassiaobtusa中分離出兩個新的葸醌類化合物。通過IR、MS、1HNMR及元素分析確定了它的結(jié)構(gòu) 定它們的結(jié)構(gòu)。并對它們的抗氧活性和構(gòu)效關(guān)系做了研究。eta／．(2004)^Ad)aylilies中離出9個新的蒽醌類化合物，測定它們對乳腺癌，CNS它們的lC∞為1．8Itgml"1-21．Ipgml"1。Maria等 一種霉菌Drechsleraa嗍的代謝產(chǎn)物中分離出一種新的蒽醌cynodontin(3．methyl-5tetrahydroxy-anthanthraquinone)，并對它的活性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，該化合物Y時的生長有明顯抑制作用，而對其它種類的霉I暫沒有抑制作用蒽環(huán)類化合物是最大類抗腫瘤的葸醌衍生物。這類葸環(huán)類坑生素首次AkStreptomyces的代謝產(chǎn)物中分離獲得(張蓉穎eIaLl999)．它們的共同結(jié)構(gòu)特征是大多數(shù)化臺物含有一個由個共平面的六元環(huán)所構(gòu)成的四苯并三苯醌發(fā)色團(tuán)(Wang“o／．1993)，是一類非常有效的抗癌et以(2000)報道合成了一系列l(wèi)，3．二羥基-9，lO．蒽酮的衍生物(結(jié)構(gòu)見圖4)，并測定它們對Hep3t3，PLC／PKF／5等7個腫瘤細(xì)胞抹的抑制作用。絕大多數(shù)衍生物都對這7照顯的抑制作用，構(gòu)效關(guān)系表明，N．響化合物的活Huangeta／．(2003)報道在葸醌的l，5位上連接了1,5．雙硫代和l，5．雙酰氧基團(tuán)并研究了該系衍生物對聚合酶的抑制作用，發(fā)現(xiàn)這些葸醌衍生物對癌細(xì)胞的hTERT的表達(dá)沒有抑制作用，但3個衍生物對正常細(xì)胞中的hTERT產(chǎn)生激活作用。這種現(xiàn)象暗示著這些蒽醌衍生物在細(xì)胞的壽中起著重要的作用Dinorab基因，如3．羥基丙氨基：另一類是有氧化還原作用的基團(tuán)，如硝基芳香基團(tuán)，吡啶和吡啶翁等結(jié)果表明，具有陽離子取代基的衍生物具有細(xì)胞毒作用，而沒有氧化還原活性；有氧化還原作的衍生物類對P3883第一章文獻(xiàn)綜a／．(1997)根據(jù)大黃酸的結(jié)構(gòu)合成了由于二乙酞大第一章文獻(xiàn)綜a／．(1997)根據(jù)大黃酸的結(jié)構(gòu)合成了由于二乙酞大黃酸能用于治療骨關(guān)節(jié)炎Daneta／．(1995)在蒽醌的l和2位上引進(jìn)了一系列順鉑類絡(luò)合物，從中研究蒽醌和順鉑化合物與DA作用的協(xié)同效果，顧鉑、DA和插入劑三體系相互作用的關(guān)系，以及它們的抗癌活性，結(jié)果表明：連接在蒽醌l位上的順鉑類絡(luò)合物比2位上的抗癌活性強(qiáng)，與DNA／怍用的鍵合常數(shù)測定2．2．1氣相色譜Lewis曾試驗在熔凝硅石毛細(xì)管柱上分析了18種天然蒽醌化合物。先把蒽醌化合物硅醚化后再用氣相色譜法分離。每一個化合物的峰都能被鑒別出，利用此法從決明然葸醌類化合物制備成衍生物。已報導(dǎo)的衍生物有三氟乙酸酯、甲醚、三甲基碎醚等，它SE-30、UCW-98、OV-17等同定相上能得到良好的分離效果。蒽醌衍生物的保留時間隨羥基的2．2．2高效液相色譜Ohshimaeta1．(1986)使用梯度溶劑洗脫的HPLC薈大黃素和大黃素的葡萄糖甙等。劉三康等(1998)片IHPLCC18色譜柱，甲醇冰(78：22)其它葸醌化合物。唐小波等(2000)采用檢測波長254nm，2．2．3薄層層析RaietaL(1981)在硅膠G薄層板上，應(yīng)用適當(dāng)?shù)恼归_劑，能將大黃酚、大黃素、大黃素甲醚、大黃酸和蘆薈大黃素等5種蒽醌類混合物較好的分離開。所用的展開劑為：甲苯一乙醚-乙醇(4：1)。Rai等(1982)和異丙醇．乙酸乙酯．水(4：4：3)2．2．4毛細(xì)管電泳腈緩沖溶液，毛細(xì)管柱75姍Ai,d×60cin，上作Od,壓19kv，紫於檢測波長254nm，在10miIl有效的定量檢測大黃素、人黃酚、大黃酸、人黃素甲醚和蘆薈人黃4中國農(nóng)業(yè)大學(xué)博上學(xué)位論22．5堿梯度提取堿梯度提取法是從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)博上學(xué)位論22．5堿梯度提取堿梯度提取法是從中草藥中分離天然蒽醌化合物最常使用的方法．該方法是根據(jù)天然蒽酮酚羥基的酸性及蒽酮環(huán)上a’B’·r掘基的酸性的差異，依次用5％KHC03、5％Na2c03、和大黃酸等002-I臨界流體萃取002．a(chǎn)t矗采用硅膠柱層析法，洗脫溶劑系統(tǒng)有石油醚一氯仿、正己烷·乙酸乙醑等2．2．7高速逆流色譜(Yicio1996(2006)統(tǒng)中藥大黃中的蒽醌類活性成分進(jìn)行了分離研究，采用三氟乙酸作為保留酸，氨水作為洗脫堿，95析，證明得到了大黃蒽醌的五種純物質(zhì)(Vaslikiotis＆Alexaki- 1972)和熒光法(Fakecva＆Tsirulnikova1980)，此外還可1978)等，20世紀(jì)80年代以來的新方法有離子反HPLC法(Gagliardi“01．1987經(jīng)活絡(luò)，止咳怯痰等功效，還能抗菌，抗病毒和抗癌等．在對植物病原菌的活性上也有一些究朱廷儒等報道(1985)，從虎杖中提取的醚溶物經(jīng)色譜柱分離得到大黃素(emodin(phscon)198，Changetal．1996)，大黃素、大黃素．8一葡萄糖甙等對金黃色葡萄球菌、肝炎雙球菌有抑制作用。MIC51993)。李成林(1989)報道大黃索對金黃色葡萄球菌209P、大腸桿菌1993)。李成林(1989)報道大黃索對金黃色葡萄球菌209P、大腸桿菌球菌作用不明顯福氏痢疾稈菌均有抑制作用。茍奎斌等測定了來自大黃的4種蒽醌類化合物即大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃酸皆對胃幽門螺旋桿菌(I-if')較強(qiáng)的抑制作用，同時證明無抗菌作用的某些成分對HP的生長也有抑制作用(茍奎斌eta1．1997)．Agatwal等從大黃(Rheumemod／)的根部分離出大黃酸(rein)、大黃素甲醚(phycio)、蘆薈大黃素(aloe-eodin)和大黃酚(chrsophan0)等蒽醌衍生物，生物活性測定表明這些蒽醌衍生物對白色假絲酵母(CandMaalbicana)，新生隱球酵母(o弦魄口∞Ⅺnon)，發(fā)癬菌屬(chnegpe)和煙曲霉(Aelafumigatus)均有不同程度的抑菌活性，MIC在25pgmLl—250pgmL"1(Agarwaletal．2000)。等(Levinetal．2000)的研究表明從蘆薈中提取的總醌類化合物對細(xì)菌Bacillussubtilis有抑制作用機(jī)理是抑制了核酸的合成．)報道大黃索劑量為‘，在離體條件下能分別抑制9種土壤細(xì)菌(．m，4種inwtriquetra擔(dān)子菌Free．Wilson和Hansch方法對六茜草素及其衍生物的抗菌活性進(jìn)行TQSAR葸醌有較強(qiáng)的抗菌活性<粱劍平et以2．3．2抗病毒作大黃素等葸醌類物質(zhì)具有抗病毒作用，可抑制乙型肝炎抗原陽性。治療慢性肝炎，急性性肝炎(張喜云1999)。Susan(2001)等報道了大黃酚能有效的抑制小兒麻痹病毒2型和3mL"1和其lc"分別為O．21ttgmL一。Raymond等(1990)報道了大黃素等蒽醌抗HIV病毒研究結(jié)果，其中大黃素抗HIV-I活性的Ec∞為36．3tiM。Sydiskis(1999)和Anderson等(1999)道虎杖大黃素對HSV-I、HSV-22．3．3抗癌DNA堿基對中，破壞DNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。另外在細(xì)胞氧化還原的代謝環(huán)境中，總醌化合物能產(chǎn)05H20，在某些具有還原性的金屬，如鐵、銅等作用下，產(chǎn)生高活性的OH"，影響DNA合物能抑制人早幼白細(xì)胞(HL-60)。機(jī)理主要是抑制細(xì)胞DNA和RNA的合成。以大黃素的細(xì)胞毒作用最強(qiáng)。大黃素比箕葡萄糖甙具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒作用，而其他成分沒有這種構(gòu)效關(guān)系．大黃素對小鼠肉瘤、小鼠肝瘤、小鼠乳腺癌、小鼠艾氏腹水癌、小鼠淋巴肉瘤、小鼠黑色素瘤及大鼠瓦克癌等7個癌株的抑制率均都在30％以上(鑰鍵&郭力芳1993)。胡凱文等(1998三種已對阿霉素、柔紅霉素產(chǎn)生多藥耐藥的腫瘤細(xì)胞株為研究對象，觀察大黃素、大黃酸對上敏感細(xì)胞更易受到殺傷。su甜a／．(1995)報道采用SOS染色測試技術(shù)。研究大黃素抑制1-NP6腸桿菌PQ37基因的突變的作用．實驗結(jié)果表明大黃素能阻止和壓制i-NP對大腸桿菌pQ37的基因突變．HisasMet吐(2001)評價了從植物中提取的一系列蒽醌類化合物的抗人乳腺癌MCF-7的作2．3腸桿菌PQ37基因的突變的作用．實驗結(jié)果表明大黃素能阻止和壓制i-NP對大腸桿菌pQ37的基因突變．HisasMet吐(2001)評價了從植物中提取的一系列蒽醌類化合物的抗人乳腺癌MCF-7的作2．3MCF7沒有鰲合的羥基對抗癌活性是很重要的．研究結(jié)果還證明大黃素等蒽醌類化合物能抑制17¨E二醇結(jié)合人體雌激素受體(Eft)．ZhangetaL(1995)，王淑如＆陳瓊?cè)A(19'77)和肖軍軍等報道了大黃素具有抗乳腺癌和抗肝癌的作用鄭豐等(1994)報炎初期缺血(吳建西，1997)．祁紅等(1999)報道大黃素具有顯著抗炎作用，一次口服‘—60mgkg-I能顯著抑制角叉菜膠致小鼠足跖腫脹，60mgkg．1—100mgkg．1能顯著抑制角mg 制醋酸引起的小鼠毛細(xì)管通透性的增加。腹腔給藥40mg蟮1能顯著抑制角叉菜膠引起的犬鼠急胸膜炎的滲出與白細(xì)胞游a／．(1995)類化合物對脂類氧化有很強(qiáng)的抑制作用，抑制作用比維生素E還強(qiáng)。 at．(2000)采用硫酸鹽方法，以亞麻酸為氧化對象。測定大黃素、大黃酚、大黃酸、蘆薈大黃素等醌類化合物的抗氧化作用，抗氧化活性順序為蘆薈大黃素>大黃酸>大黃素。而大黃酚則加劇詎麻酸的氧化．他們認(rèn)為大黃素和蘆薈大黃素的抗氧機(jī)理與羥基有很大關(guān)系。人黃酚的氧化活性是由?。岣吡俗援a(chǎn)生能力乏3．6大黃素類蒽醌注射液對麻醉兔有明顯降壓作用，連續(xù)給藥幾次后，藥量蓄積，小劑量即可引起血壓驟降甚至死亡。大黃素類蒽醌注射液對麻醉兔有明顯減低心率作用，未發(fā)生心電圖有其它改變(方秋文1982)。大黃素對多種血管有舒張作用，能抑制5．羥色胺對血管的收縮作用(吳建乞3．7在離體豚鼠回腸實驗中，用大黃素1．9雌mL"1劑量時，可使腸管肌肉張力短時增高，振幅增調(diào)正作用(吳建新eta／．1997，呂金勝et口，．2000，靳珠華etaL1984)．2．3．8修復(fù)損傷的t}ttMt保護(hù)大腦皮層神經(jīng)元功7第一章文獻(xiàn)綜馬瓊英等(1999)報道大黃素濃度為10第一章文獻(xiàn)綜馬瓊英等(1999)報道大黃素濃度為10艇幾時對人胚大腦大腦皮層神經(jīng)元有保護(hù)組分Chagea／．199DNA修復(fù)O姬R)，RCCL王文俊等(1995)報道大黃素具有激活單核細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子a(TNF-a)和白細(xì)胞介l'6，8(ILl，I¨，11．,-8)作用，并且能抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的上述因子的分泌。他們還報道(1995黃索能協(xié)調(diào)植物血凝素fH)并激活單核細(xì)胞分泌I-2和干擾紊TIFN大鼠腸粘膜的組胺含量恢復(fù)至正常水平(109kg"1灌胃或loogkg。腹腔注射)。焦建杰等()認(rèn)為大黃素可抑制白三烯B4(L1m4)的生物合成，抑制大鼠腹腔巨噬細(xì)胞(M甲)生物合成其抑制的濃度范圍5xlo-7．5xl礦M的大黃素相當(dāng)氟滅酸(1×l曠M)的抑制作用，對前列腺2．3．10對細(xì)胞內(nèi)外ca“的19a．1995)(IF．C)c2(15)熒光指示劑乙酰羧甲酸方法分析了大黃素對大鼠肝細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度影響，預(yù)先經(jīng)過大黃素mM)處理10min，在靜息狀態(tài)或加入M的CaCl2和Kcl后，細(xì)胞內(nèi)ca2+均比對照組明顯增2．3．¨對基因襲達(dá)的影姜曉峰等(1999)報道大黃素能抑制小鼠艾氏腹水癌細(xì)胞對【3H】-胸苷的跨膜轉(zhuǎn)運，其lc，o9．9“M，能增強(qiáng)抗癌藥5一氟脲嘧啶絲裂霉素和氨甲蝶呤對人肝癌BEL-7402的細(xì)胞毒作用，并分逆轉(zhuǎn)人乳腺癌細(xì)胞MCF．wAdr對飼霉素的抗藥性。丈熒素能增強(qiáng)羅丹明123在MCF-T／Ad嘲胞中蓄積并減少其外捧，長時間作用降低了P-糖蛋白的表達(dá)，表明大黃素逆轉(zhuǎn)抗藥性的作用與抑核苷轉(zhuǎn)運、降低P．糖蛋向的功能和表達(dá)相關(guān)。劉志紅等(1996J]包C-myc原癌基因表達(dá)的影響。大鼠生長相對靜止?fàn)顟B(tài)時的腎小球系膜細(xì)胞(Mc)的c-mycmRNA表達(dá)，細(xì)菌脂多糖(LPS)10mgL-130sc-myRNA高效應(yīng)在2．5h6h，(25mg2．3，12對酶活性抑制作陳萬生等(2001)研究了大黃素·8一良B．m毗喃葡萄糖苷(PMEO通過小鼠跳臺實驗以及膽堿酯酶活力測定，表明PMEC堿所致學(xué)習(xí)記憶障礙具有防護(hù)作用，對乙酞膽堿酷酶具有可逆的抑制作用，其lc，0為進(jìn)行抑制活性研究，結(jié)果表明大黃素對PTKs有強(qiáng)的抑制活性，IC50為5#M。大黃素甲醚和大8素．8-O-D葡萄塘無抑制活性，并且證明大黃素是一種非競爭性抑制荊，其機(jī)理是閫接性的調(diào)節(jié)ATP的結(jié)合位點。Yimeta／．(1999)報道了大黃索可選擇性地抑制酪蛋白激酶II(ⅪI)的活性，roP蛋白激酶白激酶C(PKC)。cdc2，酪蛋白激酶素．8-O-D葡萄塘無抑制活性，并且證明大黃素是一種非競爭性抑制荊，其機(jī)理是閫接性的調(diào)節(jié)ATP的結(jié)合位點。Yimeta／．(1999)報道了大黃索可選擇性地抑制酪蛋白激酶II(ⅪI)的活性，roP蛋白激酶白激酶C(PKC)。cdc2，酪蛋白激酶I(CⅪ)和酪蛋白激酶Ⅱ(Cl(1I)，大黃素對CKil的IC豫為2pM，低于其他激酶2．3個數(shù)量級，酶活力分析表明，其競爭性抑制CKll的活性，抗ATPKi值為pM。表明大黃素是一種選擇性的CKII抻制荊，機(jī)理為間接性的調(diào)節(jié)ATP的結(jié)合點。茜素可與DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶產(chǎn)生強(qiáng)相互作用．茜素是HIVI蛋白酶的小分子非肽非競爭性抑制劑，此類型結(jié)構(gòu)的化合物有望發(fā)展成為預(yù)防和治療AIDs的新藥物(Koziowski＆Watson1992，Brncoth＆Faril95)．茜素對從人體組織和鼠肝中分離得到的GST同功酶均有不同程度的抑制作用(Dasta／．1986)．還可抑制谷胱甘肽還原酶(Bimnaiteeta／．1991)(CostanfionetaL1996)．茜素對體外非酶促和酶促的脂質(zhì)過氧化均有抑制作用(LiuetaLHuangetaL(1995)認(rèn)為茜素對脂質(zhì)過氧化作用的抑制高于維生素E，并且二苯基-問三硝基苯腙肼試驗證實茜素是自由基清除劑2．3．13Mullereta／．(1999)采用單細(xì)胞瓊脂糖電泳技術(shù)，小核測定及突變實驗對大黃素、大黃酚，大會產(chǎn)生基因毒，而大黃索甲醚和大黃酚不會產(chǎn)生基因毒。但是他們認(rèn)為在人們正常的平衡飲食況下，蔬菜、草藥和果汁中的大黃素不會產(chǎn)生基因毒的風(fēng)險。對于l，8乳動物產(chǎn)生基因毒尚無定論(Brusick＆Mengs1997)?；⑤^蒽醌衍生物99kg"1一周未見死亡(鑰鍵&郭力芳1993)。Stefan等(1999)研究了大黃素及蘆薈大黃素等蒽醌化合物對哺乳動物細(xì)胞基因毒。研究了大黃素及蘆薈大黃素等葸醌類化合物與小牛胸腺DNA樸酶¨和小鼠淋巴瘤L5178Y的作用，同時與對照物m-AMS、EMS進(jìn)行比較。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)大黃和蘆莖丈黃素不會引起基因突變乞3．14化摩作化感作用是指一種植物通過釋放化學(xué)物質(zhì)到環(huán)境中對其他植物產(chǎn)生的影響cachalinense提取的大黃素對萵苣(Lactucasativa)、白蔸菜eta／．(1993)報道從植物viridis)和牧草(Phleumpratense)幼苗的生長有抑制活性。大黃素在劑量為10mL-I．100峙mL-1能抑制向日葵(局嘲∞脅mmⅢW，LD∞為45pgmLl’和玉米LD∞為65mLl)2．3．15對檀物病原蕾的安銀嶺(t994)等報道了大黃素、大黃酚、大黃酸等化合物對植物病原真菌細(xì)鏈格抱Vat．castaneaestenuis)、盤多毛孢(Pestalotiaspp．)、栗盤色多隔孢(Coryneum9—■_量大墨位|—■_量大墨位|文■■■■■■—目●■■—目墨量皇—■■—■■|量—■●●■鼉量曼皇■■■■—■■—大麥白粉菌(BlumeriagraminiJf．sp．HordeD有良好的活性，Ec如分別為4．7峙mL"1、0．48腭mL一，對稻瘟病菌(Magnaporthegr缸ea)有較好的抑制效果，但對供試的水稻紋桔和20．0肛菌(Coractumsasakt)、番茄灰霉病菌(BotrytUcinema)、番茄晚疫病菌(Phytophthoratnfest,aⅡ)tora)的種子的提取物中分離到大黃素、大黃素甲醚、大黃酚和大黃酸等蒽醌類化合物，并證它們在盆栽條件下對供試的小麥白粉病(Blumeriagramlnlf￡sp．以aci)、黃瓜灰霉病(置clnerea)馬鈴薯晚疫病(Pinfestans)等具有不同程度防生物測定，結(jié)果表明。以l，4-萘醌為母核，C．5或C．8位加羥基抗菌活性無明顯變化；C2或甲基取代則抗菌活性喪失；但保留C-2羥基，C．3位上有親脂性基團(tuán)能夠使抗菌活性得以一定的保留，說明親脂性的側(cè)鏈對抗菌活性有貢獻(xiàn)，前提是親脂性基團(tuán)logp值在2．5-4之間，芳香類的側(cè)鏈或相對大的基團(tuán)會使活性完全喪失。蒽醌類化合物大黃素、l，8·二羥墓葸醌有一定的抗菌活性，1964)，對愛氏腹水癌細(xì)胞的影響是強(qiáng)烈抑制呼吸和酵解(陳瓊?cè)A甜a／．1980)，是～體電子傳遞系統(tǒng)的抑制劑(陳瓊?cè)Aet口f．1987)。但蒽醌衍生物對植物病原菌的作用機(jī)制研究甚少·植物eotiscaiesia的葉部甲醇提取物能夠誘導(dǎo)多種作物的抗病性(emt／．9)。最近在該植物中發(fā)現(xiàn)了大黃素甲醚之外另一活性組分大黃紊甲醚苷。試驗顯示至少～植物抗病激活劑(plantactivator)導(dǎo)植物產(chǎn)生具有廣譜性、持久性和滯后性的抗病性能。具有如下特誘害的侵襲：(2)生的抗瘸性存在滯后性；(5)不會對病原菌有選擇壓，不易產(chǎn)生抗藥性；(6)對不具有致病的腐生菌、頡頏菌無影響，有利于維持生態(tài)平衡和環(huán)境保護(hù)(范志金甜a／．2005)植物抗病激活荊根據(jù)來源分為生物源和非生物源兩類。生物源植物抗病激活劑有蛋白類(harpin蛋白)和寡糖類(寡聚葡萄糖)及糖蛋白類(從酵母的反轉(zhuǎn)錄酶中獲得的糖肽)等。已經(jīng)報道的非生物源抗病激活劑有內(nèi)源的乙烯(Et)、水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)和一氧化氮(No)，外源的苯并噻二唑(BTH)、DL．-J3．氨基J4酸(BABA)、2，6-二氯異煙酸(INA)及其甲酯烯丙異噻唑(probenazele)、2,2--．氯一3，3-二甲基環(huán)丙羧醑(DDCC)、N-氰甲基．2．(NCI)、水楊酸甲酗(MeSA)、茉莉酸甲酯(MJ)和乙膦鋁、磷烯丙異噻唑(probenazele)、2,2--．氯一3，3-二甲基環(huán)丙羧醑(DDCC)、N-氰甲基．2．(NCI)、水楊酸甲酗(MeSA)、茉莉酸甲酯(MJ)和乙膦鋁、磷酸1PO+)、草酸鹽、2,4-D、NAA、M．A，環(huán)丙烷、十二烯醣鹽酸及一些化學(xué)除草劑氟樂靈、甲磺樂靈、仲丁靈等2∞3．Mitohollefdteta／．2002,Go'口胞壁限制了營養(yǎng)物從寄主向病原菌的擴(kuò)散；木質(zhì)素前體本身可能對病原菌有毒或通過附著在細(xì)胞物的拮抗劑，抑制孢子萌發(fā)和菌絲生長，有時還可抑制和鈍化病原菌產(chǎn)生的毒素和酶活性(王華甜以2000)。誘導(dǎo)物處理植物后過氧化物酶、多酚氧化酶、苯并氨酸解氨酶和幾丁質(zhì)酶活性增加，苯并氨酸解氨酶是木質(zhì)素和酚類化合物合成的關(guān)鍵酶和限速酶，當(dāng)植物被誘導(dǎo)后活性明顯增強(qiáng)，與木質(zhì)素含量增加趨勢相吻合，并與誘導(dǎo)抗性表達(dá)存在相關(guān)性(來經(jīng)元etaL1999物保衛(wèi)素(Phytoalexin)的合成與積累：受到病原菌侵染或激發(fā)子刺激后所產(chǎn)生或積累的一類菌性次生代謝物，對屬于黃酮類、類萜、呋喃香豆素、聚乙炔和葡糖螢類化合物(王金生1995)．病程相關(guān)蛋白：在健康植株中不存在或表現(xiàn)微弱，當(dāng)放不同的誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)時迅速產(chǎn)生積累的報道：水楊酸(SA)主要激活了PR-I、PR-2(13-1，3．葡聚糖)、PR-5(thaummin-protein)PR4基岡的表達(dá)；活化醣(811-1)激活了PR-I、PR-2、PR-5、PRl0基因的表達(dá)；榮莉酸甲酯激活了PR-3、PR-4、PDFi．2的表達(dá)；乙烯利(Ethylene)激活了PR-3，PR4(兒丁質(zhì)酶)和的表達(dá)eta／．，1994)；內(nèi)源信號分子SA、JA、Et和NO進(jìn)行的抗病信號傳導(dǎo)途徑的活eta／．1997，Ton甜a1．2002)；已經(jīng)證實水楊酸在植物抗性反應(yīng)和誘導(dǎo)抗性信號傳級聯(lián)中是一種內(nèi)源信號分子，其與植物體內(nèi)一種同源II型過氧化氫酶基因(C越2Nt)結(jié)合，形了水楊酸的生物學(xué)靶標(biāo)蛋白質(zhì)(酶)，這種蛋白質(zhì)在誘導(dǎo)抗性中起重要作用，另由研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞壁結(jié)合的受體激酶(Walk)參與了誘導(dǎo)抗性的信號傳遞(董合忠etaL2002)。Walld基因誘導(dǎo)死亡。水楊酸對細(xì)胞內(nèi)生理生化反應(yīng)的調(diào)控可能是通過肌醇磷脂信號系統(tǒng)的介導(dǎo)來完成的．水楊酸在信號傳導(dǎo)過程中所起的作用，可能是一種電子供體，為過氧化氫酶的過氧化提供電子，使水楊酸變成氧化態(tài)的水楊酸自由基，同時抑制過氧化氫酶的活性，產(chǎn)生水楊酸．這可能涉及水楊酸4．研究目本研究小組已經(jīng)從63種植物中以不同提取方式獲得T73黃瓜灰霉病菌進(jìn)行了較為系統(tǒng)的生物活性測定，以期篩選獲得無公害殺菌荊或其先導(dǎo)化合物。菊科的牛蒡、蒼耳，茄科的辣椒，十字花科的芥、萊菔，豆科的決明，蓼科的羊蹄、土大黃、大黃，第一第一章文獻(xiàn)綜中，藥用大黃、巴天酸模和土大黃提取物的保護(hù)和治療活性均較明顯，具有較大的開發(fā)潛力(喻大昭daL2004a，2004b)。本項研究是在此基礎(chǔ)上，對其主要活性物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的分離和純化，明確植物源蒽醌衍生物對主要的農(nóng)作物病原真菌在生物活性，闡明蒽醌衍生物構(gòu)效關(guān)系及其作用第二章天然蒽醌化合物的分離純化。結(jié)構(gòu)鑒定和生物話第二章天然葸醌化合物的分離純第二章天然蒽醌化合物的分離純化。結(jié)構(gòu)鑒定和生物話第二章天然葸醌化合物的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定和生物活1．1．1供試檀所張朝成副研究員鑒定顯微熔點測定儀，溫度計來校正；BrukerAC-80型核磁共振儀，DMSO和CDCI，為溶為內(nèi)標(biāo)；Waters公司2696型液質(zhì)連用儀，CISSunFireTM的C18柱150mm相乙腈：水=20：80，質(zhì)譜Quattromicr01’MAPl型；層析用硅膠和檢測用薄層板為青島海洋化工廠出品，硅膠100～160mesh，薄層板0．25mm，510縮得總浸膏829、浸膏339、浸膏D71g，剩余部分899；巴天酸模分別得浸膏F569、G779、H409、1659，剩余甲醇洗脫為mesh硅膠柱層析，以石油醚(60-90℃)：乙酸乙醑=30：1-2進(jìn)行梯度洗脫，每200mL流分收集I份，根據(jù)薄層板點樣監(jiān)測結(jié)果，合并相同流分．依次得到流分12-40得化合物1(50mg，采用乙酸乙酯重結(jié)晶)、流分45-65得化合物11(42mg10g’用同樣的方法依次到：流分10,,34的化合物V(47mg，采用乙酸乙酯重結(jié)晶)，流分40-58的化合物V1(38的化合物VIll(28mg，采用甲醇．氯仿重結(jié)晶)(流程圖見圖2．1)第二章天然葸醌化合物第二章天然葸醌化合物的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定和生物活田2-I天然產(chǎn)物提取、分膏、純化渲程Figure2-1Theprocedureofextract,isolationandpuration1．1．4活性成份的結(jié)構(gòu)鑒將上述8個組分采用薄層板點板分析，發(fā)現(xiàn)I和V、II和Ⅵ、IV和Vi兩相展開的Rf同(1和V0．4，Ⅱ和VI：O．53，V和I：O．2)，得到5個化合物。為了便于生物活性測定和測定化學(xué)結(jié)構(gòu)，代號統(tǒng)一編為：I(代表IV)，2(代表If)，3(代表lid，6(代表I)，7(代表VIII)CDl3或DMSO在液質(zhì)聯(lián)用儀上測定紫外吸收和分子量1．2．1植物租提物的活性測藥用大黃乙醇租提物的田問防治效果評價將乙醇的提取物，在田閫以黃瓜白粉病和番茄灰霉病為靶標(biāo)，評價含上述化合物的植物提取物的田問防治效果。黃瓜白粉病防治試驗于2005年lO—11月、2006年5~6月分別在武昌和襄樊進(jìn)行；番茄灰霉病試驗于2006年在武昌進(jìn)行。試驗地常規(guī)栽培管理，試驗前后未施用其他殺菌劑。小區(qū)面積均為20m24自粉病以15％Z唑酮可濕性粉劑(江蘇建湖縣農(nóng)藥廠生產(chǎn))作對照。番茄灰霉病以40％嘧霉胺可37--10d施第2次藥。第2次藥后15d調(diào)查病情，根據(jù)‘田間藥效試驗準(zhǔn)則(一)'操作規(guī)程評價藥效活性追蹤將石油醛、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取藥用大黃和巴天酸模的浸膏分別測定第二章天然蒽醌化合物的分離純化、結(jié)構(gòu)第二章天然蒽醌化合物的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定和生物話栽條件下對大麥白粉病的防治效果，以確定活性物質(zhì)在提取物的哪一段．然后進(jìn)一步分離純化得單體化合物?；钚詼y定方法為：培養(yǎng)大麥苗至一葉一心。在微量噴霧塔內(nèi)噴施以上各樣品的釋液3ml，設(shè)噴清水和與處理相同量的DMSO+吐溫20水溶液分別作空白對照和陰性對照．以清16h-d)培養(yǎng)。接種后 d記載葉片上孢子堆數(shù)，計算每葉平均孢子堆數(shù)和保護(hù)效果，每處理3次1．2．2植物單體化合物的活性測供試檻袖病原真菌1種。均為湖北省農(nóng)科院植保土肥研究所植物病理研究室提供(見表O工供試化合物共計7個化合物(見表2-6)，分別為分離純化獲得的5個化合物，從北京化學(xué)劑公司獲得的茜素，從中國生物制品鑒定所獲得的1，8-二羥基蒽醌。將化合物分別溶解在中(ImgmL4)作為母液，用蒸餾水稀釋，吐溫20作為乳化荊和展著劑，最終的濃度250PgmL"1．化合物的試驗濃度均為10PgmL"。和40PgmL"1et口f．2001)。將1．2．1的活性追蹤方法。稻瘟病菌：分生孢子在番茄燕麥汁培養(yǎng)基上獲得250lgm．I205lmL用手持噴霧器將孢予懸浮液噴接在旌過藥的大麥植株上，在飽和濕度和26士0．5℃下避光培養(yǎng)36h后見光培養(yǎng)，相對濕度約90％．接種后約120h，空白對照充分發(fā)病，調(diào)查單葉片病斑數(shù)，計算每葉平均病斑數(shù)和防治效果．防治效果(％)t(空白對照每葉病斑數(shù)一處理每葉病斑數(shù)對照每葉病斑數(shù)x100％d，最適合條件視菌離體測試：將供試菌株接種于PDA平扳中部，在23--28℃下培養(yǎng)而異；用直徑為6ram的打孔器沿菌落外緣制成菌餅備用。將供試化合物溶液分別配制成100mLl和400PgmL‘，然后將溶液與PDA培養(yǎng)基按1：9體積比混合均勻后(即稀釋lO倍)，制成直徑為90mnl不含供試化合物的PDA平板和含與供試化合物溶液相同量的DMSO+吐溫20分別作空白mm)，用照和陰性對照，以消除溶劑的影響．待空白對照處理菌絲充分生長后(直徑接近標(biāo)卡尺十字交叉法測定各處理菌落直徑(mm)，計算抑菌效果．抑菌效果％=(對照菌落直徑處理菌落直徑)，(對照菌落直徑一菌餅直徑)×1000,6第二章天然葸醌化臺物的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定和生物活囊2．1供試真■一Table2-1Yunplspeciesusedin病原代病害通用勘靠，恤ci艇￡!!噬多種植第二章天然葸醌化臺物的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定和生物活囊2．1供試真■一Table2-1Yunplspeciesusedin病原代病害通用勘靠，恤ci艇￡!!噬多種植ol斜灰霉Vm'ious菌核病油菜OilA／ternar／a加ta(Fires)Keiss炭疽病煙草A毫辣椒赤霉病禾谷樊Fu口NightbloomingcⅢs輪紋病Applering叩南蘋果小麥Rkizoctonia鉀陀dbVaadcr紋枯病Sharp對B軟腐病甘薯sweet臼粉病PowdefyBlumeriagramlnis(Dc)EOSpoor型堡磐業(yè)逝f衛(wèi)旦幽2盟大麥融時堅2．1結(jié)構(gòu)鑒化合物I(大黃酚，chrysoplⅧmol，3-甲基一l，8--"羥基葸醌)：黃色結(jié)晶，m．P．195～196℃， 信號，為蒽醌化合物的羰基典型信號ppm處有2第二章天然蒽醌化合物的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定和生物活 第二章天然蒽醌化合物的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定和生物活 桔紅色針狀結(jié)晶，m．p．198^-199"C，分子式為C17H140s．UV^。一223．5，280．5，425．5，El-2．42(3H，s，CHD。oCH，)，6．75(1H，d，J=2．5Hz，7．H)，7．OS(1H，b7．55(1H，b略。伸)，13．07(1H，s，OH)．‘3C-NMR在為蒽醌化合物的羰基典型信號化合物1V(大黃素，em04in，3-甲基．1，6,8-=羥基蒽醌)：橙黃色針狀結(jié)晶。m．P．25．％-分子式為CisHi005．uVk“．221．5，287．5，440．5，EI-MStn，z：271．1(M+)．。 d，J---3Hz，2-H)，7．80(IH，d，J=3Hz，4-H)。12腫(IH，brs，6-OH)，12．10(1H。ppm范圍內(nèi)有4個叔碳，8個季碳信號，這是羥基蒽醌的典型信號為CisHs06．UVk。：228．5，257．5。430．5，El-MSm／z：285．1(M+)．1HNMR(DMSO-5．8．14(1H，d，．盧1．5Hz，H-4)，7．81(1H。t，j-7．7。8．2Hz，H-6)，7．78(IH，d。J=1．5Hz，H．2)，7．75(1H，d，J--7．5Hz，H-5)，7．42(IH，d．J-8．3Hz，H-7)，12．06(a-OH)．1℃小啦HH曲H：CcOO啊2-2供試■■化合鞠的化學(xué)結(jié)Figure1-2ThclNmical柚mct_n1．2．1檀物粗提物的生物活性測藥用大黃乙醇租提物的田問防治效果在田間的試驗表明，藥用大黃乙醇的提取g)防治白粉病、70％嘧霉胺第二章天然蒽醌化臺物的分離純化，結(jié)構(gòu)鑒定和生物活分散粒劑稀釋第二章天然蒽醌化臺物的分離純化，結(jié)構(gòu)鑒定和生物活分散粒劑稀釋1000倍(609)的防效相當(dāng)(見表2．2和2-囊2．2萄用大冀的扭取物對黃瓜白棚的田閆防治效果囊2-3大黃的攫取鈾對番茄灰霉病的田問防治效活性追蹤采用大麥白粉病菌對藥用大黃和巴天酸模的分離物進(jìn)行活性追蹤。第1到的浸膏分別稀釋1000倍，采用1．2．2的活體測試方法測定對大麥自粉病的生物活性。發(fā)現(xiàn)氯仿段B或G的防治活性展高，其他部分的活性較低，因此確定氯仿浸青進(jìn)行下一步分離純化確定活性物質(zhì)(見表2-4)：將氯仿浸膏進(jìn)行分離、重結(jié)晶后稀釋10000倍對小麥白粉病菌的生物活性寰2_4藥用大黃和巴天鼉橫的分膏物稀釋1000倍對大蠹白糖病■的防治效Talde2-ABCE"m強(qiáng)"GFHJ鰭鴕帕D加b第二章天然葸醌化合物的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定和生物活襄2_5藥用大量和巴天鼉第二章天然葸醌化合物的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定和生物活襄2_5藥用大量和巴天鼉橫的分膏袖囂■10(100蕾對大蠢白糖囊■鼓防治效珊IU"柏ⅥV葸醌化合物對11個供試植物病原真菌的生物活性測定結(jié)果見表2-6和圖2-3和在活體條件下，3個蒽醌類衍生物大黃素甲醚、大黃素．1,6-zepmL"’時大黃較高的活性，在40pgmL"’時的防效分別為99％，97％和98％，在lO大黃q1醚lO¨gmL"’時防效為97％和92％的防效，但大黃酚的防效僅5％。同時上述個化合物對稻瘟病也表現(xiàn)較高的活性，在40PgmL"’時的防效分別為80％、82％和70％，在mL"1時大黃素甲醚和大黃素一1,6---甲醚的防效為54％和44％，但犬黃酚lO有9％1極性較高(含羥基較多或羧基：大黃酸，大黃素、1,8-二羥基葸醌和茜素)的蒽醌衍生物的活性．在離體條件下。供試蒽醌類化合物對供試的9個菌的活性并不高。僅大黃酸對黃瓜灰霉3討對植物病原真菌的活性中起主導(dǎo)作極性較低(大黃素．I，6．二甲醚、大黃酚、大黃素甲醚)的葸醌衍生物在植株上對病原菌的生物活性。明顯優(yōu)于極性較高(含羥基較多或羧基)的蒽醌衍生物，如大黃酸、大黃素、l，8-二羥基蒽醌和茜素的活性。這可能是極性較低的蒽醌衍生物有著比極性較高的衍生物更適合被植物胞吸收，從而對入侵的病原菌產(chǎn)生作極性較高(含羥基較多或羧基)的蒽醌衍生物，如大黃酸、大黃素、1，s．二羥基葸醌和茜素對病原的直接抑菌作用要優(yōu)于極性較低(大黃素一l，6-二甲醚、大黃酚、大黃素甲醚)的蒽醌衍生物．這可能是因為在離體條件下(含藥培養(yǎng)基)極性更高的葸醌衍生物含有的羥基和羧基等親水基第二章天然葸第二章天然葸醌化合物的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定和生物活藥用大黃乙醇的提取物，對黃瓜白粉病和番茄灰霉病菌具有良好的防治效果．其稀釋100和250倍的防效分別與對照藥劑15％三睦酮可濕性粉嗣稀釋1000倍防治白粉病、70％嘧霉胺一Nm一嘈N卅n■N喇nnn■n*nⅢn州onn書n，喇H州●制onn*n■拿nm●■一卅n書蜀H十N■n*H卅。n十上H■上28．—●。。。尊魯。。。。。。noon*n書H坩一Nm一嘈N卅n■N喇nnn■n*nⅢn州onn書n，喇H州●制onn*n■拿nm●■一卅n書蜀H十N■n*H卅。n十上H■上28．—●。。。尊魯。。。。。。noon*n書H坩。ii一一-·一善七高-H。。。。。。。未苫鲞。Iiii憊．^2oi；。。。。曼a i乞i2j掣蜒囂州巽心輔霉好，暈蒙鍵容g釋如摹醒鋤群K摒■孵nn—々未：：莖。墨盞。。。。蘭I薯罟nJ葛uI晶■囂善Ⅱlj口是葺苫tJ々掃l^弓一妄--；。。鋤9-Hi翟益■杈錯掣撲二1壁撲<刳《啞壬霉如，富暑薏目—々-9．_一§qcl0∞昏6．蚤善^4wp-∞．一砸!I『m。th_口n40nlgL-稻瘟病MagnaportheL-40nlgL-稻瘟病MagnaportheL-洼No協(xié)：1--emed抽，2--phyd,m，3一l—dm咖●o研—m礎(chǔ)n·4一婦咖，5一I^棚崎m嘲哼柚曲nqm呻辨，6--daTmphanet·7一中國農(nóng)業(yè)大中國農(nóng)業(yè)大學(xué)博L學(xué)位論第．章天然總醒化合物的分離純化，結(jié)構(gòu)鑒定和牛物活田2-4墓蠢衍生麓對9種檀物病原真■的抑曹活生，I-大羹t。2--大冀●單一。3一大冀●-1,6--甲18，4-蕾囊，S--hS---羥tt■，6一大姍。7一大曩^‘咖1--modll·2--pl攛tou，3--1㈨-emoauP4--sdimdn,5一l，枷dm酵蛐曲r_—h噼，6一曲町M—哪IoI，7--rl岫第三章大黃素甲醚和大黃酚對白粉病第三章大黃素甲醚和大黃酚對白粉病菌活性的增效作第三章大黃素甲醚和大黃酚對白粉病第三章大黃素甲醚和大黃酚對白粉病菌活性的增效作由最fidig／nea引起的黃瓜白粉病和且gram／n／s大范圍嚴(yán)重減產(chǎn)eta／．1996，AskaD,eta／．_1997)。施用大量化學(xué) 使用大黃素甲醚和大黃酚是存在于植物Fab∞e∞(Ca目／aspp．)，Polygonaccae(Rhewn，mMPolygonumspp．)和Rhammlcene(Rhamnus和Ventilagospp．)中的天然蒽醌類化合物，可以從些植物的根部以柱層析等色譜方法提取和分離獲得(李建北＆林茂￡sp．odMrhd)，黃瓜白粉菌，水稻紋枯病菌(RicoaonKhn)，灰霉病菌(且“Pe：s)和黃瓜霜霉病菌(Peudopronspracubnsideary)(hoita／．2004)。在我們先前的黃瓜弁粉病菌的生物活性測定試驗中，主要含有人黃素甲醚和大黃酚的植物提取物在同等劑量時的活性優(yōu)于兩個單體化合物的活性，顯示兩者存在時有潛在的增效作用。為了．證實這個現(xiàn)象的大黃素甲醚(純度98％)和大黃酚(純度9S％)對照品從國家醫(yī)藥和生物制品檢定所獲得．含有大黃素甲醚和大黃酚的植物提取物的制各；根據(jù)優(yōu)化了的陳瓊的方法，制備用于溫驗的植物提取物(Cherteta／．2001)。將大黃的根磨碎，采用20％H2S04+氯仿(1+5體積水浴中回流3h，氯仿相先用0．25％氫氧化鉀水溶液萃取，然后有機(jī)相用5醚和大黃酚在薄層板上(硅膠mesh。0．25nun)的Rf值分別為0．74和0．53，油醚+乙酸乙酯(15+l體積)。根據(jù)氣象色譜分析結(jié)果，該植物提取物中大黃素甲醚和大黃mm以25oCvain"1升溫到230"C，再以20ocmin"‘升溫到290oc并持續(xù)15rain．進(jìn)樣和檢測溫度min和23．50為2500C，進(jìn)樣體積為2¨L。大黃素甲醚和大黃酚的保留時間分別為第三章丈黃素甲醚和大黃酚對自粉病和小麥白粉病菌(置gram黃瓜白粉病菌RH，16h的光周期第三章丈黃素甲醚和大黃酚對自粉病和小麥白粉病菌(置gram黃瓜白粉病菌RH，16h的光周期。小麥白粉病菌的培養(yǎng)條件為IS4-IoC連續(xù)光照。當(dāng)大量的分生孢子形成時，贏接作為接種體感病黃瓜品種長春密刺。播種在直徑為200mm盛有豐富腐殖質(zhì)土壤的塑料缽中．在溫室生長3q周后。將第4片真葉離體，用蒸餾水沖洗和紙巾吸干后，以打孔器制成直徑為15的葉圓片．每6個葉圓片擺在1個盛有n'fffl的培養(yǎng)皿中備用。感病mL水瓊脂、直徑為麥品種鄭93播種在直徑為200m盛有豐富腐殖質(zhì)土壤的塑科缽中。在光照培養(yǎng)箱(18主70％RH和連續(xù)光照每5段葉片擺在1個盛有20mL水瓊脂、直徑為90mm的培養(yǎng)皿中備大黃素甲醚、大黃素甲醚和大黃酚的復(fù)合物(9：l，8：2，7：3，6：4．5：5，4：6，3：7，2：8，and以10,2．5，0．63，O．15和0．04PgmL"1的劑量施用，大黃酚以PgmL"‘的劑用80在溶液中的最終濃度為0．025％(v／v)．噴霧采用自動噴霧塔，噴壓為0．25[V[PaPWT-510)，噴霧量為 mLm-2。根據(jù)預(yù)備試驗結(jié)果，陰性對照和空白對照無顯著差異，因此采用性對照作為此試驗的對迅速蓋上皿盞后在黑暗中保濕培養(yǎng)(25士loc)，24h后移到16h麥葉段在接種塔中接種，接種量800～1000分生孢子／cm2，然后放置在18．4-Ioc和連續(xù)光照的養(yǎng)箱中培養(yǎng)防效％=100×(空白對照一處理)／空白對照mL"‘，采用手持噴霧器噴霧．量均為IOmgmL-l，天然提取物的施用劑量為10，2．5和0．63陰性對照為對照，施藥24h小麥品種鄭98播種在直徑為200mm的塑料缽，每缽14株，于溫室中培養(yǎng)(約14-22。C)。當(dāng)二葉充分展開時，采用洗耳球?qū)⒎稚咦哟到拥街仓晟?。接種后d情：0無??；l病斑面積占葉片面積5％以下；3病斑面積占葉片面積6--15％；5斑面積占葉面積16--25％：7斑面積占葉片面積26-50％；9斑面積占葉片面積超過51％中國農(nóng)業(yè)大學(xué)博上第三章丈黃素甲醚和大黃酚對白粉病感病黃瓜中國農(nóng)業(yè)大學(xué)博上第三章丈黃素甲醚和大黃酚對白粉病感病黃瓜品種長春密刺，播種在直徑為200inln盛有豐富腐殖質(zhì)土壤的塑料缽中，每缽(2×l曠分生孢子mL"1)。接種后14d調(diào)查葉片上白粉病菌落數(shù)。試驗為隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，4次10．0軟件；大黃素甲醚、大黃酚和組合物的EC舶根據(jù)Gisi的方法劑量一反應(yīng)回歸采用根據(jù)如下公式計算理論A和B分別代表大黃素甲醚和大黃酚；a，b大黃素甲醚和大黃酚相互作用的類型根據(jù)如下公式Ec50油，是根據(jù)觀察值計算出來的EC50值。如果R值不顯著高-f-i．0(O．扣1．5)，表示加性作用如果R值高于1．5表明增效作用：如果R值低于0．5，表明減效作用(Gisi溫室試驗的數(shù)據(jù)采用變量分析，平均值的比較根據(jù)Dunc．a(chǎn)n’s多重比較2結(jié)從兩次獨立的試驗中獲得類似的結(jié)果(見表3．1和表3-2)．大黃素甲醚顯著高于大黃酚對白病菌的活性。對于小麥白粉病菌，丈黃素甲醚和丈黃酚組合物的R值(理論EC√觀察EC∞兩者含量的變化為0．99~2．78，對于黃瓜白粉病菌，大黃素甲醚和大黃酚組合物的R值(理論√0O．(在組合物中的比率為6：4"-9：1i：9～5：5時，則表現(xiàn)為增效作用．增效水平隨著大黃酚在組合物中的比率的增高而升高采用天然組合物劑量為0．63一mUl時，小麥植株菌落數(shù)顯著低于大黃酚在劑量為pg，mL的病情：天然產(chǎn)物劑量為10病情嚴(yán)重度和黃瓜葉片上的白粉病菌落數(shù)與大黃素甲醚表3．)。這表明大黃素甲醚和天然組合物比大黃酚對自粉病具有更高的活性．天然組合物了存在與大黃素甲醚和大黃酚間的增效作用第三章大黃素甲醛和大黃酚對自粉病菌的增效作囊3-1大羹囊甲t，大黃■和天然曩臺■在童內(nèi)對小蠹自硼的生栩11K受鯉!鯉惻垡＆蟲塑i墅塑④堡絲!塑鯉!Q!塑翌鯉i墅!絲一0．14(0．12一一a螂∞供Ⅲ，．1914．40-一一一一Combination0．1610．14-0．1研CombinationCombhutionCombinationCombin砒0．24r0．21-第三章大黃素甲醛和大黃酚對自粉病菌的增效作囊3-1大羹囊甲t，大黃■和天然曩臺■在童內(nèi)對小蠹自硼的生栩11K受鯉!鯉惻垡＆蟲塑i墅塑④堡絲!塑鯉!Q!塑翌鯉i墅!絲一0．14(0．12一一a螂∞供Ⅲ，．1914．40-一一一一Combination0．1610．14-0．1研CombinationCombhutionCombinationCombin砒0．24r0．21-0．25fo．22-壘嬰§也苧i嬰ratioofcoml，i--．a(chǎn)tionshphyscmtodaysoplmd”TheratioofthⅢreticalECsotoolamved虻裹3-2大黃素甲蠢、大黃酚和天然混合物在室內(nèi)對黃瓜自粉病的生物活性一Table3-2．Thefungicidalaetivlties／n訥andtheircombinationsoR吧趔!空巴!!坐!i苧生￡!§皂11lcfirstt1hcsecond嬰a(雌蟲芝墅!!塑i 0．24f0．21-一一一一一一一Combination0CombinationCombination0．28m．2A-Combination1．II．o．7．0．42《0．37-o．39(0．35-2：Q：竺i!：!!生：絲1：第三章大黃素甲醚和大黃酚對白粉病囊3-3大第三章大黃素甲醚和大黃酚對白粉病囊3-3大奠蠢甲奠，大黃醴和天然混合鈾在噩童條件下對小囊白糟痹的防效比Table3-3EHectsofphysCion。chrysophmlolendtheirnaturalextract¨plantpowderymildewInDiseasecolonies伽cucmnbi型幽Disa鐘hKk-xFirst注·同一欄中相同標(biāo)有字母的數(shù)據(jù)在0脅東平無顯薯差異#··大黃素甲蕞與大黃酚JfL之-比為笠t竹Note：*Meanswithin^∞II時mfollowedbytheI蚰tl眈時舯notIi馴fi銣嘶di伍erenlat，=005mragoofphymond_叩0p岫3討([zhaki202)cnae(ChieLL1995，作用我們先前的研究發(fā)現(xiàn)主要含有大黃索甲醚和大黃酚組分的大黃提取物(足面鈀i砌如)對植物白粉病的生物活性隨著批次的不同有所變化(數(shù)據(jù)為列出)。目前的結(jié)果顯示這種變化是由于這兩種活性成分在不同批次中的比率不同造成。兩種組分比率的變化導(dǎo)致不同的增效程度，和不第四章大黃素甲醚對白粉菌和霜霉菌的敏感基線第四章大黃素甲醚對白粉菌和霜霉菌的敏感基第四章大黃素甲醚對白粉菌和霜霉菌的敏感基線第四章大黃素甲醚對白粉菌和霜霉菌的敏感基線研n1．1996,Shid以2002)．抗病品種全球性病害(kabl?。山l鋤ty脯1963，Khan1970，黜獅推廣旅用不能完全取代生產(chǎn)上對化學(xué)農(nóng)藥的需求(Mcormh甜以1996)。使用合成化學(xué)農(nóng)藥舫治病害 eta／．2004,Kim“a／．2004)。這類農(nóng)藥不僅有較為廣泛的殺菌譜而且容易生物降解，對環(huán)境友好et根據(jù)我們和其他研究小組的研究結(jié)果，大黃(包括足officinalFBaill,兄胛砌礎(chǔ)ⅢL．，tanguticumMax：nnRegel．足emodi,置erispusL．，尼laciniaturaPralll等)的乙醇提取物，能夠在溫室和大田防泊黃瓜、小麥和大麥白粉病(嗡大昭eta／．2004，Choi“a／．2004)．Bary)(蔣繼志＆梁寧2005)，番茄灰霉病(Botrytiscinerea)，小麥條銹病稻瘟病(Magnaporthe神∞)(Cl∞i甜K￡thn2004)，草莓根腐病ColetorchmleopoiidscrE)(蔣繼志et娃2001)，辣椒和番茄病毒病等(Zhu＆Chiu1989；Guoeta／．1998)。此外，植物ReynoutriasachalinensisP}．的提取物，含有一種重要的蒽醌類活性成分犬黃素甲醚，在1990年l掃CompoGmbH(MOnster,Germany)公司昂早商業(yè)化為可濕性粉laflasig)HergerKlingauf,Daafyet口王1995．Konslanlinidou-Doltsiniseta／．2006)，同時對灰霉病和煙草花葉病也有效d1996，F(xiàn)ritz1996)saehalinensis的葉分離到系列蒽醌類化合物。并且證實他們對靶標(biāo)植物病原菌有生物話性1990,Kimefa／．2004。ChoietaI．2004。Konstanfinidou-Doltsiniseta1．2006。Yueta／,2001，Kim“a／．2004，Choi“a／．2004)。殺菌劑的抗藥性已經(jīng)成為化學(xué)藥劑防治病害的嚴(yán)重問題。20世紀(jì)90年代開發(fā)的具有新型作機(jī)制的丙烯酸酯類殺菌劑能有效的防治對麥角甾醇抑制劑、生物合成抑制劑和脫甲基抑制劑類菌荊有抗藥性的病害(Margot甜以1998)．然而，由于丈量和不合理的使用，作物病原菌對烯酸酯類的抗藥性很快就產(chǎn)生了1999,Ishiieta／,2001，Margot甜a／．1998殺菌劑對靶標(biāo)病原菌的敏感墓線(應(yīng)該在該殺菌劑推廣使甩之前，Justumet以1998)對于評估抗目前大黃根的乙醇提取物在中國正在開發(fā)為防治黃瓜白粉病和霜霉病的植物源殺菌劑(Veguardo,0．5％大黃素甲醚水劑，北京清源保生物科技有限公司)。從2004年到2006年兩年八的一種重要活性成分，在本文作為供試化合物來測定2004-2006中國農(nóng)業(yè)大學(xué)博上第四章大黃素甲醚對白粉菌和霜霉菌的敏感基線的敏感基線。同時，實驗室條件下測定了黃瓜白粉病菌XZ4中國農(nóng)業(yè)大學(xué)博上第四章大黃素甲醚對白粉菌和霜霉菌的敏感基線的敏感基線。同時，實驗室條件下測定了黃瓜白粉病菌XZ4基亞楓(DMSO)為母液，避光保存在40Cmg大黃素甲醚溶于2004～2005年黃瓜生長季節(jié)，在包括北京、武昌、鄭州，南京、天津、孝感、荊州、成都和長沙等9個地區(qū)的溫室和大田采集感染白粉病和霜霉瘸的標(biāo)樣，每個地區(qū)采集ll《7葉分別用塑料代保存，葉柄包上濕棉球黃瓜自粉病標(biāo)樣放在254-loC、12h光周期的光照培養(yǎng)箱中，2d后用分生孢子轉(zhuǎn)移到健康新鮮的黃瓜子葉上繁殖。接種后的黃瓜子葉放進(jìn)盛有2％水瓊脂的培養(yǎng)皿上皿蓋后置光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)至產(chǎn)孢黃瓜霜霉病標(biāo)樣在184-IoC保濕避光培養(yǎng)12h誘導(dǎo)產(chǎn)孢。采用微量移液器用無菌水將黃瓜105分生孢子mL"1)，吐溫20的濃度為0．025％(v／v)，然后孢子懸浮液用雙層鏡頭紙過濾同樣，供試黃瓜霜霉病菌的孢子囊懸浮液(約 10'孢子囊mL"1)也按此法制備大黃素甲醚系列劑量10．0、2．5、0．63，0．15和P．gmL"1用于黃瓜白粉病菌的Ec∞測定，系劑量12．5、3．125、0．78、O．19和最終濃度為0．025％(v／v)。根據(jù)預(yù)備試驗結(jié)果，陰性對照和空白對照的病情沒有顯著差異，而設(shè)陰性對照為試驗對照對于白粉病測定，采用自動噴霧塔(O．25MPa。PWT-510)將大黃素甲醚水溶液噴施到葉片上．噴施與大黃素甲醚溶液相當(dāng)?shù)腄MSO+Tween20水溶液作為陰性對照，噴霧量為25mlm-2。藥液陰干后，將黃瓜子葉剪下擺放在盛有2％水瓊脂直徑為60mm的培養(yǎng)皿中，每皿擺放3片葉。用手持噴霧器噴施自粉菌孢予懸浮液進(jìn)行葉面接種，葉面水珠陰干后蓋上皿蓋，在25．4-I。C條件16h。采用透明膠帶將子葉表面的孢子取樣后放在事先滴加0，1mL油混合(乳酸坩油，水=1／2／1，v／v／v)的載波片上，蓋上蓋玻片在第四章大黃素甲醛對白粉菌和霜霉菌的敏感基線抑制率(％)=f(對照發(fā)芽率一處理發(fā)第四章大黃素甲醛對白粉菌和霜霉菌的敏感基線抑制率(％)=f(對照發(fā)芽率一處理發(fā)芽率)，對照發(fā)芽事】采用葉臻法測定霜霉病的敏感基線．在黃瓜5片真葉期將第4片真葉用打孔器制成直徑為的葉礤，將葉碟在相應(yīng)的供試溶液中浸泡5s后擺放在盛有2％水瓊脂直徑為90mm培養(yǎng)皿，每lS片．待葉碟表面水珠陰干后，用微量移液器取10嵋黃瓜霜霉病孢子囊懸浮液接種在葉臻中央．蓋上皿蓋后放在184-IoC下避光培養(yǎng)12h，然后轉(zhuǎn)移到18士16C、h光周期的培養(yǎng)箱養(yǎng)．接種后7天目測病斑面積占葉礤面積的百分比，根據(jù)Abbott的方法計算防效(Abbott防效(％)t100×【(對照病情一處理病情)，對照病情根據(jù)劑量反應(yīng)曲線計算大黃素甲醚對每個菌株的Ec，o值。采用Kolmogomv-Smimov每個地區(qū)EC∞值頻度曲線是否符合正態(tài)分布，用Kruskal．Wallisl[E間的差異。在年度問、地點問沒有顯著差異的情況下，將所有的數(shù)據(jù)合起來計算敏感基線值，分析軟件采用將Ec∞值接近敏感基線值的黃瓜白粉菌($．fuliginea)單孢分離菌株Z4作為初始茵株(GO)。將黃瓜子葉用0．829崞m"1的大黃素甲醚溶液處理(該劑量接近ETo值)。然后接種Go的分生孢子，存活下來的分生孢子用作第一代(I)。然后將l接種同樣劑量處理過的黃瓜子葉上。存活下來的分生孢子作為第二代(G2)。如此一直進(jìn)行到第15代(GIS)。對于每一代均采用1．4的值)與大黃素甲醚選擇壓力代數(shù)的相關(guān)性年度間和每一樣點白粉病菌種群的EC"中值、最小值、最大值、種群大小、變異因子等列0．513，>0．05)，ECho值的變異范圍為0．153-4)A54PgmLl，平均值為0．304(士(見圖4-1)．9個地區(qū)白粉病菌種群的變異因子的變化范圍是1