益生菌制劑在致病菌感染防治中的應(yīng)用

益生菌制劑在致病菌感染防治中的應(yīng)用

腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)是人類最大、最復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)（微生態(tài)系統(tǒng)）。它中有大量不同大小和類型的細(xì)菌，大多數(shù)在年輕時(shí)被獲得。不同菌種之間通過拮抗和共生關(guān)系,以及微生物與宿主之間的相互作用關(guān)系達(dá)到消化道微生態(tài)系統(tǒng)的平衡,對于阻止腸道紊亂和致病菌感染非常重要,這種平衡狀態(tài)一旦被打破,就易引起菌群失調(diào),給腸道致病菌及條件致病菌的生長提供機(jī)會(huì),造成腸道疾病的形成,見圖1。由腸道致病菌引起的慢性胃炎、胃潰瘍、腹瀉類疾病、慢性腸炎等疾病每年在全球?qū)е录s兩百多萬人死亡。臨床上通常使用抗生素類藥物對這類疾病進(jìn)行治療,這樣會(huì)增加致病菌的耐藥性而使病情加重。因此,針對致病菌感染及其對多種抗生素的抗性問題,無殘留、不產(chǎn)生抗藥性、無毒副作用的益生菌制劑無疑具有廣闊的開發(fā)和應(yīng)用前景。雖然目前臨床中許多益生菌已被用來預(yù)防或治療各種胃腸疾病,包括感染性腹瀉、新生兒腸炎、慢性結(jié)腸炎、腸易激綜合癥和炎癥性腸病。但是目前對臨床應(yīng)用益生菌抑制致病菌引起的腸道疾病的作用機(jī)制并不明了。一般認(rèn)為益生菌在臨床治療腸道致病菌引起的炎性疾病的分子和細(xì)胞機(jī)制主要涉及以下幾個(gè)方面。本文主要從這幾個(gè)方面闡明益生菌抑制致病菌的作用機(jī)制。1益生菌的特性致病菌黏附到腸上皮細(xì)胞的機(jī)制之一是和腸上皮細(xì)胞表面分子的受體結(jié)合,而益生菌細(xì)胞壁上的表面大分子能夠阻斷或抑制致病菌和這些受體的結(jié)合。非致病菌在腸上皮細(xì)胞黏附位點(diǎn)的占據(jù)抑制了致病菌的入侵,同時(shí)在生態(tài)位點(diǎn)對營養(yǎng)的爭奪也限制了致病菌的過度繁殖。益生菌能夠黏附在腸上皮細(xì)胞中微絨毛的刷狀緣和黏膜層,通過腸蠕動(dòng)很難將其帶出腸道,這也是益生菌抑制腸道致病菌定殖生長的前提條件。乳酸桿菌的細(xì)胞壁上由不同的大分子組成,這些大分子對益生菌的一些特性起到?jīng)Q定性作用,見圖2。研究表明,益生菌與宿主的相互作用主要與菌體S-層蛋白(S-layerprotein)、脂磷壁酸(Lipoteichoicacids,LTA)和胞外多糖有關(guān)(Exopolysaccharides,EPS)等。1.1s-層蛋白和致病菌S-層蛋白是由蛋白質(zhì)或者糖蛋白亞基組成,呈規(guī)則的晶狀排列,形成了能夠覆蓋整個(gè)細(xì)胞表面的固態(tài)表層。乳酸桿菌表層蛋白的分子量在25-71kD之間,是已知表層蛋白中分子量最小的一類。乳酸桿菌表層蛋白的等電點(diǎn)為9.35-10.4,均為堿性蛋白,這是乳酸桿菌獨(dú)有的特性。乳酸桿菌表層蛋白的氨基酸組成與其他表層蛋白的氨基酸組成基本相似,含有大量疏水性氨基酸,含量在31.9%-38.7%之間。正是因?yàn)楦吆康氖杷园被?S-層蛋白才不會(huì)被水等溶劑溶解,這是S-層蛋白自動(dòng)聚集性的基礎(chǔ)。另外,S-層蛋白中高含量的疏水性氨基酸也有助于乳酸桿菌與致病菌競爭黏附位點(diǎn),進(jìn)而對致病菌的黏附起到一定的阻礙作用。相對于其它細(xì)菌而言,目前已發(fā)現(xiàn)的含有S-層蛋白的乳酸菌并不多,主要包括嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)、瑞士乳桿菌(L.helveticus)、短乳桿菌(L.brevis)、卷曲乳桿菌(L.crispatus)等,見表1。S-層蛋白與致病菌競爭黏附腸上皮細(xì)胞的受體,進(jìn)而能夠增強(qiáng)益生菌的益生功能。Horie等研究結(jié)果表明,將L.crispatusJCM5810菌株用鹽酸胍去除S-層蛋白后,其顯著降低了L.crispatus抑制致病性E.coli黏附到上皮細(xì)胞的能力。Chen等研究表明L.crispatusZJ001經(jīng)過5mol/L的氯化鋰處理后,其抑制E.coli和S.typhimurium對Caco-2的作用和聚合能力都消失,證明了S-層蛋白與致病菌競爭抑制黏附的作用。Johnson-Henry等研究了L.helveticusR0052對E.coliO157:H7黏附HEp22和T84上皮細(xì)胞的抑制作用,發(fā)現(xiàn)S-層蛋白發(fā)揮了重要作用,SDS分析表明提取的S-層蛋白的分子量為48kD,體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)S-層蛋白可抑制E.coliO157:H7對HEp22的粘附。Bergonzelli等研究發(fā)現(xiàn)L.johnsoniiLa1中的S-層蛋白除了存在于細(xì)胞壁表面,同時(shí)能夠分泌到培養(yǎng)基中,有關(guān)于S-層蛋白是否具有抑制致病菌生長的作用還有待于研究。另外,Golowczyc等研究發(fā)現(xiàn)分離于kefir中的L.kefir和其S-層蛋白能夠抑制S.enteritidis對上皮細(xì)胞的黏附和侵襲。Hyn?nen等研究發(fā)現(xiàn)菌株L.brevisATCC8287的S-層蛋白與人腸上皮細(xì)胞具有親和性,這也是其能夠發(fā)揮抑制致病菌黏附的主要機(jī)制。同時(shí),我們課題組從傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離篩選了一株副干酪乳桿菌M5-L,能夠顯著抑制宋內(nèi)志賀菌對HT-29細(xì)胞的黏附作用,主要是S-層蛋白發(fā)揮主要作用,進(jìn)一步對S-層蛋白的氨基酸組成研究發(fā)現(xiàn),其中疏水性氨基酸的含量達(dá)到40.52%,推測可能是這種疏水性氨基酸有助于M5-L抑制致病菌黏附作用,其中的脯氨酸含量為2.81%,其富含脯氨酸(Proline)的結(jié)構(gòu)可插入上皮細(xì)胞的SH3結(jié)構(gòu)域的疏水區(qū)域中,可能與黏附機(jī)制有關(guān)。另外,有研究表明有些乳酸桿菌的S-層蛋白是介導(dǎo)乳酸桿菌與宿主腸道細(xì)胞黏附的主要介質(zhì)。而且,具有黏附性的S-層蛋白與其預(yù)防致病菌的黏附作用及其益生特性也會(huì)有著必然的聯(lián)系。正是因?yàn)檫@個(gè)原因利用S-層蛋白對致病菌感染進(jìn)行治療已經(jīng)引起了研究者的興趣,例如利用它作為活的目標(biāo)抗原載體;目前研究已經(jīng)證明可以將外源的抗原決定部分整合到S-層蛋白的亞基上,而在乳酸桿菌的S-層蛋白形成一體。因此?vall-J??skel?inen等用鹽酸胍提取分離的98株乳酸桿菌的S-層蛋白,然后進(jìn)行SDS分析,篩選出6株菌產(chǎn)生S-層蛋白,其分子量主要分布在45-62kD,并進(jìn)一步研究其作為抗原的載體。1.2通過調(diào)控細(xì)胞表面黏附形成間接影響乳酸桿菌的胞外多糖(EPS)具有復(fù)雜結(jié)構(gòu),不僅糖單體特性存在差異,而且單糖的鏈接、分支和替代方式也存在不同,構(gòu)成乳酸桿菌菌種特有的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)。EPS通過影響細(xì)胞表面理化特性,在乳酸桿菌的生物性和非生物性表面特異性相互作用中起關(guān)鍵作用。另外,EPS也通過屏蔽其他細(xì)胞表面黏附因子對黏附形成間接影響。Ruas-Madied等發(fā)現(xiàn)胞外多糖對于益生菌和腸道致病菌的黏附作用起到調(diào)控作用。EPS主要是做為宿主配體或致病菌凝集素,調(diào)節(jié)致病菌的黏附作用。Neese等研究發(fā)現(xiàn)L.johnsonii對EPEC和ETEC的抑制主要是與致病菌競爭糖基黏附位點(diǎn)。Mukai等發(fā)現(xiàn)L.reuteri通過與Helicobacterpylori競爭上皮細(xì)胞表面中相同的糖基位點(diǎn),使得H.pylori失去黏附位點(diǎn)而被排出體外。EPS起到空間排阻的作用。由此可見,EPS作為益生菌和致病菌的競爭結(jié)合位點(diǎn)在抑菌機(jī)制中起主要作用。1.3對益生菌表面的黏附作用脂磷壁酸(LTA)為乳酸桿菌和雙歧桿菌細(xì)胞外層的疏水成分,起到非特異性黏附作用。LTA在益生菌表面形成微毛結(jié)構(gòu),構(gòu)成益生菌黏附過程中的配位體。另外,LTA具有低等電點(diǎn)特性,這樣就會(huì)導(dǎo)致益生菌表面分布多為負(fù)電荷,這種靜電作用成為益生菌與受體細(xì)胞黏附的基礎(chǔ)。腸道益生菌表面的分子類結(jié)構(gòu)物質(zhì)LTA,可識(shí)別腸上皮細(xì)胞表面的黏附受體位點(diǎn)而引發(fā)與致病菌的競爭性黏附。乳酸桿菌L.johnsoniiLa1對于Caco-2細(xì)胞的黏附作用能被由該菌提取的LTA抑制。目前據(jù)資料報(bào)道,LTA是雙歧桿菌表面的主要黏附物質(zhì),另外雙歧桿菌中LTA還具有很多生物活性。1.4g培養(yǎng)物添加量除了通過各種機(jī)制維持腸上皮細(xì)胞的物理屏障外。益生菌也能刺激腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞保護(hù)物質(zhì),如熱休克蛋白和β-Defensin。益生菌LGG培養(yǎng)物上清中的可溶因子可以誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生熱休克蛋白。E.coliNissle1917可以上調(diào)腸上皮細(xì)胞中β-Defensin的產(chǎn)生,來阻止病原菌對腸上皮細(xì)胞的黏附和入侵。雙歧桿菌產(chǎn)生的胞外糖苷酶,能降解腸黏膜上皮細(xì)胞上的雜多糖,從而起到阻止致病菌及細(xì)菌毒素對腸上皮細(xì)胞的黏附作用,如青春雙歧桿菌的β-呋喃果糖苷酶,可催化1-蔗果三糖、棉子糖和菊糖等寡糖,起到消除致病菌利用其進(jìn)行黏附的作用。2致病菌的共聚能力益生菌在人體腸道內(nèi)形成一個(gè)屏障從而抑制病原菌的入侵,是發(fā)生益生作用的一個(gè)主要機(jī)制。尤其是益生菌株與致病菌的共聚合作用是其有效抑制致病菌在腸道內(nèi)定殖的一個(gè)主要作用機(jī)制。有研究者認(rèn)為乳酸桿菌與致病菌的共聚,有助于致病菌從腸道中移除。Sch?r-Zammaretti等研究了L.coryniformisDSM20001T與致病菌的共聚能力及其乳酸桿菌表面蛋白之間的關(guān)系,乳酸桿菌上凝集促進(jìn)因子具有介導(dǎo)L.coryniformisDSM20001T與E.coliK88、C.coliDSM4689T和C.jejuniDSM4688T的凝集作用。另外,在研究L.acidphilusM92對豬回腸上皮細(xì)胞的黏附特性時(shí)發(fā)現(xiàn),該菌株表面存在S-層蛋白,可以介導(dǎo)L.acidphilus與E.coli3014、S.typhimurium的協(xié)同凝集作用。3菌的生長特性乳桿菌作為益生菌中應(yīng)用最廣的菌種,在體內(nèi)抑制致病菌的主要機(jī)制就是能夠?qū)χ虏【纳L環(huán)境造成限制,主要是通過產(chǎn)生大量的短鏈脂肪酸(乳酸、乙酸、丙酸等)、脂肪酸(苯基乳酸、對羥基苯基乳酸)、過氧化氫、細(xì)菌素或多肽等物質(zhì),抑制致病菌的生長,從而發(fā)揮生物學(xué)屏障作用,進(jìn)而抑制致病菌對腸上皮細(xì)胞的黏附作用。3.1抑菌保鮮的處理細(xì)菌素是目前研究比較熱的抗菌物質(zhì),已經(jīng)報(bào)道了乳酸桿菌產(chǎn)生的幾種細(xì)菌素類物質(zhì),但是這些細(xì)菌素的抗菌活性是有差異的。乳酸鏈球菌素(Nisin)是世界公認(rèn)安全的天然食品防腐劑;迄今為止,己有50多個(gè)國家和地區(qū)將其應(yīng)用于食品工業(yè)中。但Nisin只能抑制G+菌,對G-菌、酵母菌、霉菌及病毒一般沒有抑制作用,對由大腸桿菌、沙門菌、志賀菌等腸道致病菌無能為力,而且在中性及堿性環(huán)境中溶解度低、不穩(wěn)定而使抗菌效果大大降低。隨著研究的深入,人們的研究目標(biāo)主要集中于廣譜細(xì)菌素的開發(fā)。例如益生菌L.salivariussubsp.salivariusUCC118所產(chǎn)生的抗菌肽具有廣譜抗菌作用,對Bacillus,Staphylococcus、Enterococcus、Listeria和Salmonella菌都具有抑制作用;Lactococcuslactissubsp.產(chǎn)生的細(xì)菌素Lacticin3147能夠有效抑制C.difficile的生長。我們課題組從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離出一株干酪乳桿菌J23能夠產(chǎn)生廣譜抗菌肽,對G+和G-菌均具有抑制作用。另外,乳酸桿菌產(chǎn)生的細(xì)菌素和酸可以協(xié)同作用直接作用于病原,抑制病原體在腸道的生長繁殖。但是就目前的研究現(xiàn)狀來看,都很難闡明廣譜抗菌肽的結(jié)構(gòu)及其作用機(jī)制。3.2乳酸作為基酸類化合物part和芽孢桿菌stec乳酸是乳酸菌產(chǎn)生的重要抑菌化合物,未解離乳酸具有高脂溶性,能融入細(xì)胞膜并以未解離乳酸的分子形式滲透入特定腸道致病菌細(xì)胞質(zhì),酸化細(xì)胞質(zhì),并破壞細(xì)胞膜的底物轉(zhuǎn)運(yùn)、能量供應(yīng)、大分子合成,達(dá)到抑菌效果。乳酸桿菌和雙歧桿菌能夠代謝腸道中不被人吸收的低聚糖和氨基酸類產(chǎn)生這種有機(jī)酸,主要包括乳酸、醋酸、丙酸、丁二酸、苯基乳酸和羥基苯基乳酸等。通過產(chǎn)生有機(jī)酸降低腸道中pH值。在低酸環(huán)境下,致病菌細(xì)胞膜內(nèi)外pH值差能增強(qiáng)未解離有機(jī)酸的細(xì)胞毒性。但是有資料報(bào)道單純的低酸環(huán)境并不能抑制產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)和產(chǎn)志賀樣毒素大腸桿菌(STEC)部分耐酸菌株的活性,而是通過低酸環(huán)境來增強(qiáng)未解離乳酸的細(xì)胞毒性和抑菌能力。DeKeersmaecker等研究LGG對S.typhimurium的抑菌作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)也是由于乳酸積累的作用。Ogawa等報(bào)道益生性乳酸桿菌對產(chǎn)毒素E.coliO157:H7生長的抑制作用也是通過乳酸發(fā)揮作用的。另外,乳酸作為G-菌細(xì)胞膜的滲透劑,能夠促進(jìn)其他抑菌化合物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),起到協(xié)同抑菌的作用。有些有機(jī)酸還具有螯合特性,能夠捕獲致病菌生長的必需元素,例如鐵,從而抑制其生長。4益生菌的篩選我國是一個(gè)乳酸菌菌種資源十分豐富的國家,這為乳酸菌的研