鎖陽多糖對d-半乳糖衰老模型小鼠血液及腦組織端粒長度的影響

鎖陽多糖對d-半乳糖衰老模型小鼠血液及腦組織端粒長度的影響

《鎖陽》是《草本植物》的一種附屬藥物。它的藥效因素是“鎖陽、長盛不衰”，也被稱為“不老藥”。我國西部有豐富的鎖陽資源,內(nèi)蒙古是其主產(chǎn)地之一。鎖陽性味甘、溫,有補(bǔ)腎助陽、益精血,潤腸通便等功效。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),鎖陽有清除氧自由基、抗氧化、抗缺氧、抗應(yīng)激、抗疲勞、抗癌、抗HIV以及潤腸通便等作用。本課題組在以往的工作中也發(fā)現(xiàn)以多糖為主要成分的鎖陽水提物有對衰老小鼠的抗氧化作用,鎖陽多糖有明顯的抗免疫作用和促進(jìn)體外培養(yǎng)骨髓細(xì)胞增殖的作用。為探討鎖陽多糖對衰老小鼠基因功能的影響,現(xiàn)進(jìn)一步研究其抗衰老的作用機(jī)制。1材料表面1.1動物昆明種小鼠,內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供,合格證號SCXK(蒙)2002-0001。1.2csp的提取和鑒定鎖陽,自采于內(nèi)蒙古鄂爾多斯市杭錦旗獨(dú)貴特拉鎮(zhèn),經(jīng)內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物系陳貴林教授鑒定。新鮮鎖陽除去花序,自然干燥,粉碎,過80目篩,置于硅膠干燥器中備用。自制鎖陽多糖:取鎖陽粉末,加95%乙醇浸泡脫脂,離心取沉淀,按料液比1∶15加水,94℃下水浴提取2h,重復(fù)提取2次。上清液加95%乙醇使醇含量達(dá)到80%以上,放置24h后離心,沉淀用丙酮、無水乙醇、90%乙醇各洗滌2次得粗多糖。粗多糖加水復(fù)溶,過濾除去沉淀,以5%三氯乙酸、Sevag法去蛋白各2次,再次醇沉,沉淀物重新溶解于水,去離子水透析3d后醇沉,沉淀物經(jīng)無水乙醇至80%乙醇分級醇洗,真空干燥至恒重,得鎖陽多糖(CSP),CSP得率1.24%。將所得CSP加水溶解,以苯酚-硫酸法測得多糖含量為93.2%。經(jīng)紫外光譜測定,在260nm無吸收,280nm有小吸收峰,說明CSP樣品不含核酸類物質(zhì),含少量蛋白雜質(zhì)。精制的CSP經(jīng)凝膠高效液相色譜測其平均分子質(zhì)量1.29×105。黃芪多糖,自制,制備方法同CSP,含量91.8%。1.3dp323號dp333離心柱法基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技公司,批號DP318);熒光定量PCR試劑盒SYBR(R)PremixExTaqTM(PerfectRealTime)(大連寶生物公司,批號DRR041S)。1.4儀器ABI7300實(shí)時(shí)定量PCR儀(AppliedBiosceince,FosterCity,CA)。2方法2.1模型組及給藥組小鼠60只,體重18~22g,雌雄各半。隨機(jī)分為6組:正常組、衰老模型組、CSP低、中、高劑量組、黃芪多糖組,每組10只,雌雄各半。模型組及給藥組每日腹腔注射50g·L-1D-半乳糖500mg·kg-1·d-1,正常組給同容積生理鹽水。CSP低、中、高組每日灌胃CSP劑量分別為20,40,80mg·kg-1·d-1,黃芪多糖40mg·kg-1·d-1,正常組和模型組以等量蒸餾水灌胃。2.2紅細(xì)胞裂解法連續(xù)給藥8周后摘眼球取血約1mL,頸椎脫臼致死,取腦組織迅速液氮保存。血樣經(jīng)1000r·min-1離心10min,上清棄去,血凝塊-20℃保存。冰凍血凝塊溶化后在PE手套內(nèi)擠碎,加入紅細(xì)胞裂解液1mL,混勻器混勻15s,1萬r·min-1離心1min,棄上清,加紅細(xì)胞裂解液500μL再次處理后按試劑盒操作,得到DNA樣品100μL。所得DNA樣品-20℃保存待測。腦組織樣品取約500mg,研細(xì)后按試劑盒提取操作,步驟與血液相同,冷凍保存DNA樣品待測。經(jīng)核酸測定儀測定DNA為160~400mg·L-1,A260/A280=1.86~1.93。2.3pcr實(shí)時(shí)熒光測定和端粒長度2.3.1基因的合成端粒上游引物5′-GGTTTTTGAGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGGAGGGT-3′,下游引物5′-TCCCGACTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTA-3′。參比的單拷貝基因?yàn)?6B4基因,上游引物5′-ACTGGTCTAGGACCCGAGAAG-3′,下游引物5′-TCAATGGTGCCTCTGGAGATT-3′,引物均由大連寶生物公司合成。引物使用濃度10μmol·L-1。2.3.2引物pcr擴(kuò)增每個(gè)PCR反應(yīng)體系包括:SYBRPremixEXTaq10μL,ROXReferenceDye0.4μL,上、下游引物各0.4μL,稀釋100倍后DNA模板1μL,加滅菌水至20μL?；靹蚝髷U(kuò)增。端粒擴(kuò)增條件:94℃10s預(yù)變性,然后95℃5s,52℃31s,40個(gè)循環(huán)。36B4基因擴(kuò)增條件:94℃10s預(yù)變性,然后95℃5s,54℃31s,40個(gè)循環(huán)。應(yīng)用ABI7300實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行檢測、記錄和分析。2.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制任意取一份待測樣品作為模板,按10倍梯度稀釋共5個(gè)濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線,以模板樣品的稀釋倍數(shù)的log值對樣品達(dá)到一定閾值所需的循環(huán)數(shù)(thresholdcycle,Ct)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.3.4端粒dna長度的測定待測DNA稀釋樣品取1μL加入到20μLPCR反應(yīng)體系,每份模板分別測定端?；蚣?6B4基因的Ct值,重復(fù)測定3次,取平均值進(jìn)行計(jì)算。以T/Sratio計(jì)算端粒DNA的長度。T/Sratio=[2Ct(telo)/2Ct(36b4)]-1=2-[Ct(telo)-Ct(36b4)]=2-ΔCt。為比較觀察藥物的作用,再以D-半乳糖衰老模型組的平均ΔCt為對照,求相對T/Sratio,相對T/Sratio=2-ΔΔCt。2.4統(tǒng)計(jì)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,應(yīng)用SPSS11.0軟件采用單因素方差分析比較各組間的顯著性差異。P<0.05表示差異有顯著性。3結(jié)果3.1b4基因標(biāo)準(zhǔn)曲線模板梯度稀釋的端?；蛞飿?biāo)準(zhǔn)曲線r2=0.990,斜率=-3.02,36B4基因標(biāo)準(zhǔn)曲線r2=0.993斜率=-3.49。端?；蛟谀０鍧舛?~10-3倍稀釋線性關(guān)系良好,擴(kuò)增效率高。36B4基因線性范圍1×10-1~10-4倍。熔點(diǎn)曲線見圖1,2,可見擴(kuò)增產(chǎn)物特異,適合定量。3.2不同給藥劑量對d-半乳糖致衰老的單次給藥后相對端粒長度的影響結(jié)果顯示,CSP中、高劑量組T/Sratio與模型組相比在血液和腦組織中差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,兩組織的端粒長度變化趨勢一致。血細(xì)胞和腦組織中D-半乳糖致衰老模型組同正常組相比相對端粒長度均明顯縮短(P<0.01)。給藥后,血細(xì)胞中、高劑量CSP給藥組和黃芪多糖組同模型組相比,相對端粒長度均有明顯增加(P<0.01),低劑量組沒有明顯影響。腦組織各給藥組同模型組相比相對端粒長度均有明顯增加(P<0.01)。血細(xì)胞與腦組織端粒長度在正常與衰老模型小鼠中均有明顯不同(P<0.05)(表1)。4抗衰藥物可選用模型的建立實(shí)時(shí)定量(realtimequantitative)PCR法包括熒光嵌合法(SYBRGreenⅠ),熒光探針法等,SYBRGreen法簡單易行,價(jià)格相對較低,該法測定端粒相對長度準(zhǔn)確性強(qiáng)、靈敏度好,該方法可用來替代傳統(tǒng)的Southernblot,Q-FISH等方法測定端粒、端粒酶。端粒是真核細(xì)胞染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu),由端粒DNA和端粒蛋白質(zhì)組成。端粒DNA是富含G的高度保守的重復(fù)核苷酸序列,人和其他哺乳動物的端粒DNA序列均由5′-3′方向(TTAGGG)n反復(fù)串聯(lián)組成,它參與DNA復(fù)制,對維持染色體的穩(wěn)定和完全復(fù)制有重要作用。正常動物細(xì)胞DNA的端粒隨著細(xì)胞分裂而縮短,端粒的長度在多種類型的衰老的體細(xì)胞中都呈現(xiàn)出末端重復(fù)序列的丟失,當(dāng)端?？s短到臨界長度時(shí)細(xì)胞將停止增殖并死亡。端粒的丟失可以用來衡量培養(yǎng)基中再生細(xì)胞的衰老程度,而且在體內(nèi)可根據(jù)它判斷細(xì)胞供體的年齡,這種功能已經(jīng)在人類多種細(xì)胞或可再生組織中得到了證實(shí)。由于端粒的功能性喪失可以觸發(fā)細(xì)胞周期的停止引起衰老,因此對引發(fā)端粒重復(fù)序列丟失的模型的研究將會成為抗衰老藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)的另一個(gè)途徑。本實(shí)驗(yàn)的致衰模型采用D-半乳糖法,D-半乳糖是一種二醛糖,在醛糖還原酶作用下被還原成半乳糖醇后,不能被細(xì)胞進(jìn)一步代謝,而堆積在細(xì)胞內(nèi),引起氧化應(yīng)激、自由基損傷及誘導(dǎo)醛糖還原酶活性增強(qiáng)等一系列病理生理變化,使細(xì)胞腫脹、代謝紊亂,引發(fā)衰老。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)D-半乳糖能明顯降低血液和腦組織細(xì)胞端粒長度,可能通過端粒機(jī)制觸發(fā)衰老過程,進(jìn)一步說明了用D-半乳糖造衰老模型的方法是可行的。已有研究表明,不同組織的端粒長度并不完全相同,本實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)論與之類似,2種組織端粒長度