宮頸不同病變中hpvl

宮頸不同病變中hpvl

宮頸是婦科腫瘤中的第二例常見腫瘤，其死亡率已達到各種婦科腫瘤的水平?，F(xiàn)行的宮頸癌篩查程序使浸潤癌的病死率大大下降,同時也導致了宮頸癌前病變的過度治療。由于絕大多數(shù)宮頸低度鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)和部分高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)會自然消退,僅少數(shù)進展到癌,且迄今為止尚無預測宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)生物學行為的形態(tài)學標準,因此,臨床上迫切需要一個可靠的預后標志物以判斷CIN患者是否向?qū)m頸癌轉(zhuǎn)變。人乳頭狀瘤病毒(HPV)持續(xù)感染是CIN發(fā)生的主要原因,可以導致宮頸病變從LSIL、HSIL發(fā)展到鱗狀細胞癌(SCC)。HPVL1殼蛋白為HPV的主要衣殼蛋白,是生產(chǎn)HPV疫苗的主要抗原,HPVL1殼蛋白的表達與HPV病毒的復制和感染早期密切相關(guān),但在病毒整合到宿主DNA上以后逐漸消失,而HPV病毒整合到宿主DNA上是引發(fā)宮頸惡變的重要環(huán)節(jié),故通過檢測HPVL1殼蛋白的表達可以分析HPV感染的階段,從而預測CIN的生物學行為。本研究采用免疫細胞化學法檢測HPVL1殼蛋白在不同宮頸病變脫落細胞中的表達特點,并對其臨床意義進行了探討,國內(nèi)尚未見類似研究報道。1材料和方法1.1主要材料1.1.1細胞學診斷結(jié)果收集2008年1月至2009年5月到北京大學深圳醫(yī)院宮頸門診就診患者的宮頸脫落細胞標本309例。患者年齡18～67歲,平均年齡37.3歲。根據(jù)TBS2001年陰道/宮頸細胞學診斷系統(tǒng)進行細胞學診斷。按細胞學診斷分組:未見上皮內(nèi)病變細胞和惡性細胞(NILM)72例,意義不明的不典型鱗狀細胞(ASC-US)71例,非典型鱗狀細胞不排除高度鱗狀上皮內(nèi)病變(ASC-H)19例,LSIL80例,HSIL49例和SCC18例。依據(jù)組織病理學診斷結(jié)果分為:正常宮頸或慢性宮頸炎組33例,CINⅠ級組168例,CINⅡ/Ⅲ級組84例和SCC組24例。所有患者均無宮頸錐切、子宮切除、放化療史。異常細胞學(≥ASC-US)或高危HPVDNA陽性者行陰道鏡檢查及活檢,必要時行宮頸管診刮。1.1.2pvl1殼蛋白賽泰-細胞/組織HPVL1檢測試劑盒購自美國愛迪旺斯醫(yī)療科技有限責任公司。該試劑盒能識別宮頸細胞涂片或組織切片上的包括6、11、16、18、31、33、45和58型在內(nèi)所有HPVL1殼蛋白。因同時采用核酸水平和免疫水平雙重檢測HPVL1殼蛋白,能檢測0.01pg(10-12grams)微量的同源活性HPVL1殼蛋白,檢測的敏感度為常規(guī)免疫組化試劑盒的30倍。HPVDNA雜交捕獲Ⅱ代(HC-Ⅱ)試劑盒由美國Digene公司提供。1.2方法1.2.1彈性調(diào)的睪丸刷窺陰器暴露宮頸后,棉球輕輕擦去宮頸表面和穹窿的分泌物,用薄層液基細胞學子宮頸刷插入宮頸口,在子宮頸外口鱗柱狀上皮交界處,以子宮頸外口為中心,均勻旋轉(zhuǎn)3～5周,取出宮頸刷。1.2.2細胞染色及檢測液基細胞學標本從宮頸上刷取后立即投入到細胞保存液中,并把細胞從刷子上沖洗下來。隨后的制片及染色按照說明書進行,用于細胞學診斷及HPVL1殼蛋白檢測。細胞學診斷標準采用TBS報告系統(tǒng)。1.2.3玻片的制備按HPVL1染色試劑盒說明書進行操作。以試劑盒所提供的陽性及陰性標本片作平行陽/陰性對照。具體操作步驟如下:將制好的薄層液基細胞學涂片在96%乙醇中預先固定20min,待玻片自然干燥。將玻片在96%、75%、50%乙醇和蒸餾水1缸中各浸泡2min重新潤濕玻片。酸洗滌,預雜交及消除內(nèi)源性過氧化物酶,消除非特異性染色。加外源性HPVL1抗體,DNA雜交及加入二抗,雜交后RNA酶及免疫組化的過氧化物酶處理。雜交堿性磷酸酶染色和免疫組化AEC染色,復染及返藍。直接用水性封片劑封片,室溫暗盒保存。顯微鏡下閱片。僅有1個被紅染的細胞核即可診斷HPVL1呈陽性。1.2.4hc-的體外感染能力同時由宮頸管采取標本。采用HC-Ⅱ檢測13種高危型HPVDNA(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68)。HC-Ⅱ?qū)R-HPV感染的敏感度限定為1pg/ml。標本的RLUs/CO比值≥1.0定為HPVDNA陽性,<1.0定為陰性。1.3l1殼蛋白表達水平的比較采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析,各級病變HPVL1殼蛋白表達比較采用χ2檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。并計算宮頸脫落細胞HPVL1殼蛋白檢測宮頸高度病變(CINⅡ/Ⅲ)和宮頸癌的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值。2結(jié)果2.1不同組織病理學檢查HPVL1殼蛋白陽性細胞為細胞核著色,為表層細胞,基底細胞無表達(圖1)。309例宮頸細胞學涂片中,正常涂片72例,異常細胞學涂片237例,后者包括ASC-US71例、ASC-H19例、LSIL80例、HSIL49例和SCC18例,細胞學與組織病理學診斷情況見表1。在309例中HPVL1殼蛋白表達陽性142例(總陽性率46.0%),其中CINⅠ占78.9%(112/142),CINⅡ/Ⅲ占14.8%(21/142),正?；蚵詫m頸炎占6.3%(9/142);在HPVL1殼蛋白表達陰性的167例中,CINⅡ/Ⅲ63例及SCC24例(52.1%),CIN156例(33.5%),正常或慢性宮頸炎24例(14.4%)。CINⅠ、SCC組與正?；蚵詫m頸炎組比較,HPVL1殼蛋白陽性表達率差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。CINⅠ與CINⅡ/Ⅲ組,CINⅠ、CINⅡ/Ⅲ組與SCC組比較差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01),即隨組織病理學病變程度加重,HPVL1殼蛋白陽性表達率呈下降趨勢(表2)。NILM、ASC-US組與ASC-H組相比,HPVL1殼蛋白陽性表達率的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。LSIL、HSIL組與SCC組比較,LSIL組與HSIL組比較,HPVL1殼蛋白陽性表達率差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05),即隨細胞學病變程度加重,HPVL1殼蛋白陽性表達率呈下降趨勢。見表3。2.2pvl1殼蛋白表達與高危型pvna負荷量的關(guān)系根據(jù)相關(guān)文獻將HPVDNA負荷量分為3個等級:～100、～1000、≥1000RLU/PC。HPVL1殼蛋白的表達與高危型HPVDNA負荷量的關(guān)系見表4?！?000RLU/PC組HPVL1殼蛋白的陽性表達率高于其它3組,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。其它3組兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。與≥1000RLU/PC組比較*P<0.052.3歲組與30歲組pvld殼蛋白表達水平比較以患者年齡進行分組比較。以30歲為界分為2組,<30歲組62例中HPVL1殼蛋白陽性29例(46.8%),≥30歲組247例中HPVL1殼蛋白陽性113例(45.7%),差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。以40歲為界分為2組,<40歲組196例中HPVL1殼蛋白陽性98例(50.0%),≥40歲組113例中HPVL1殼蛋白陽性44例(38.9%),差異亦無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。2.4靈敏度、特異性、陽性和陰性預測值對比HPVL1殼蛋白檢測CINⅡ/Ⅲ以上病變的敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為80.6%、60.2%、52.1%和85.2%。3討論3.1pvl1殼蛋白表達與年齡及年齡的關(guān)系從LISL進展到HISL和SCC,持續(xù)性HPV感染是一個必要條件但不是充分條件。HPV感染由兩個階段構(gòu)成。第一階段是病毒復制階段,在此階段,病毒感染基底細胞,每個細胞內(nèi)約有50～100基因組拷貝數(shù)。早期基因E1,E2,E5,E6和E7開始表達,病毒DNA復制,因此復制階段是指HPV感染的早期階段,此階段可檢出HPVL1殼蛋白的表達。HPVL1殼蛋白主要在細胞核表達,偶爾在細胞質(zhì)表達,并位于鱗狀上皮細胞表層。第二階段是轉(zhuǎn)化階段,此階段HPVDNA整合到宿主DNA,未治療的病變進展到微浸潤和浸潤癌與HPV基因整合到宿主染色體有關(guān)。由于HPVL1殼蛋白只在復制過程中的病毒顆粒上表達,故轉(zhuǎn)化階段不表達HPVL1殼蛋白。本研究采用免疫細胞化學法檢測HPVL1殼蛋白在宮頸脫落細胞中的表達,發(fā)現(xiàn)不論是按細胞學分組還是按組織病理學分組,HPVL1殼蛋白均隨CIN級別的增加而陽性表達率下降,在宮頸癌中不表達,提示檢測HPVL1表達有重要的預測價值。Yoshida等報道63例液基細胞學(LBC)標本中(20例LISL、40例HISL、3例SCC),HPVL1殼蛋白表達率分別為30%、12%、0%,與我們的研究結(jié)果吻合。在組織病理學診斷正?；蚵詫m頸炎的宮頸脫落細胞標本中HPVL1表達率為27.0%,細胞學診斷NILM的涂片中HPVL1殼蛋白陽性率為43.1%,可能代表HPV處于感染但還未引起細胞病理改變階段。此外,細胞學為正常、ASC-US、ASC-H及HSIL的涂片中HPVL1殼蛋白陽性率分別為43.1%、40.0%、42.1%、30.6%,兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義,這提示L1殼蛋白陰性表示病毒DNA存在兩種狀態(tài):一種情況是病毒DNA整合到宿主DNA上,使細胞發(fā)生了惡性轉(zhuǎn)化,另一種是潛伏感染與低度或無病毒復制,因此,臨床工作中應結(jié)合細胞學和高危型HPVDNA結(jié)果進行分析。Rauber等報道HPVL1殼蛋白陽性率在30歲以上組比30歲以下組更常見(69.5%vs54.4%,P=0.008),Lee等報道40歲以上組與40歲以下組相比,HPVL1殼蛋白表達率下降(50.8%vs49.2%),而本研究發(fā)現(xiàn):HPVL1殼蛋白陽性率在30歲以上組與30歲以下組、40歲以上組與40歲以下組之間差異均無統(tǒng)計學意義,HPVL1表達與年齡是否相關(guān),有待進一步研究。HPVL1殼蛋白的表達與高危型HPVDNA負荷量的關(guān)系尚未見報道。我們的研究發(fā)現(xiàn):負荷量≥1000RLU/PC組HPVL1殼蛋白表達率明顯升高(73.1%),這也表明HPVL1在病毒復制階段表達,但是否提示高負荷量易有效刺激免疫系統(tǒng),預示病變消退,亦有待進一步研究。3.2pvl3殼蛋白檢測cin耐藥血早期宮頸上皮不典型增生病變絕大多數(shù)是可以自愈的,其中僅有少于9%的病變遷延發(fā)展成為宮頸癌。因為缺少能夠預測HPV感染后宮頸上皮不典型增生是否癌變的方法,目前在處理這類病變時,不得不對所有的病變進行過度和不必要的治療,這不僅危害了患者的身體健康,同時也增加了患者的經(jīng)濟和精神負擔。因此,目前的篩查程序存在一定的局限性,有必要尋找其他的檢測指標以預測CIN的進展風險。由于HPVL1殼蛋白只表達在復制過程中的病毒顆粒上,在病毒整合到宿主DNA以后逐漸消失,故HPVL1殼蛋白僅能在病毒復制階段被檢出。HPVL1殼蛋白也是細胞免疫的主要靶抗原,HPVL1的表達顯示患者免疫系統(tǒng)被激活,絕大多數(shù)CIN自愈可能與它的激活有關(guān),它在轉(zhuǎn)錄早期階段的丟失可能導致免疫系統(tǒng)的無效刺激,減少細胞免疫反應,從而促進未成熟上皮細胞的進一步轉(zhuǎn)變。因此