玉米芯微波消解-內(nèi)切木聚糖酶水解制備低聚木糖的工藝研究

玉米芯微波消解-內(nèi)切木聚糖酶水解制備低聚木糖的工藝研究

低聚糖是由2.7個木糖分子-1和4個糖苷組組成的功能性聚糖。它比甘蔗和葡萄糖低40%，與葡萄糖相似，約為40%。低聚木糖對pH值及熱的穩(wěn)定性較好,即使是在酸性條件(pH=2.5)加熱也基本不分解。低聚木糖極難被動物消化吸收,腸道內(nèi)殘存率高,具有極好的雙歧桿菌增殖性,其選擇利用性高于其他功能性低聚糖,為非消化功能性寡糖。低聚木糖是目前功能性寡糖中最能促進體內(nèi)有益菌增長的活性糖。在豬、雞生產(chǎn)中應(yīng)用低聚木糖具有以下6個方面的作用:促進動物消化道內(nèi)有益菌的繁殖,抑制有害菌生長,改善微生物菌群平衡;阻斷病原菌與宿主細胞受體的結(jié)合;刺激動物機體的免疫系統(tǒng),提高免疫力;增強動物抗病能力,減少發(fā)病率,提高對動物疾病的防治效果;改善飼料利用率,提高動物生產(chǎn)性能;降低對環(huán)境的污染,改善動物生產(chǎn)環(huán)境的衛(wèi)生狀況。隨著人們對低聚木糖認識的深入,其作為一種新型綠色飼料添加劑受到廣泛關(guān)注。玉米芯中木聚糖的含量可達到35%以上,是一種理想的制取低聚木糖的原料。壓力自控密閉微波消解是將試樣和溶劑放于耐壓密閉容器里進行微波加熱消解,自動控制密閉容器的壓力,它結(jié)合了高壓消解和微波加熱迅速以及能使極性分子在高頻交變電磁場中劇烈振動碰撞、摩擦、極化等方面的性能,可以削弱木聚糖與其他成分的結(jié)合力。我國最近就玉米芯中低聚木糖的提取也進行了一系列的研究,并取得了一定的成果。但目前我國對低聚木糖的研究主要用在食品添加劑上,不能滿足飼料工業(yè)發(fā)展的要求。本文在已有文獻報道的基礎(chǔ)上,基于薄層層析和高效液相色譜檢測技術(shù),以低聚木糖得率為主要評價指標,研究堿法預(yù)處理的玉米芯微波消解-內(nèi)切木聚糖酶水解制備低聚木糖的工藝條件,為低聚木糖在飼料中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1木二糖、燕麥木聚糖純硅膠板:60F254(德國默克公司);內(nèi)切木聚糖酶:夏盛生物技術(shù)有限公司;D-木糖,木二糖,木三糖標準品:日本W(wǎng)AKO公司產(chǎn)品;燕麥木聚糖:Sigma公司產(chǎn)品;乙腈:國藥集團,色譜純;微波消解儀:MDS-2003F,上海新儀微波化學科技有限公司;玉米芯:河南省民權(quán)縣,已經(jīng)粉碎成直徑2mm及以下的顆粒,w(水分)=7.59%,w(灰分)=2.37%。1.2木聚糖酶活性的測定酶活性測定采用DNS法。一個單位的木聚糖酶酶活性定義為:在pH5.0以及50℃條件下,1min內(nèi)水解木聚糖底物產(chǎn)生相當于1μmol木糖的還原糖的酶量,U。1.3洗后烘烤時間低聚木糖的制備采用堿法預(yù)處理玉米芯、微波消解后酶法降解工藝。堿法預(yù)處理條件為:稱取玉米芯,加入10倍體積的1.0%NaOH溶液,60℃水浴浸泡過夜,然后用水充分洗至pH自然,60℃烘箱內(nèi)烘至恒質(zhì)量。微波消解的工藝條件為:取0.5g預(yù)處理的玉米芯粉至消解罐中,加10mL蒸餾水,加蓋密封后放入消解爐中,微波處理壓力和微波處理時間根據(jù)實驗設(shè)計而變化。酶解工藝條件為:經(jīng)微波處理后的樣品加蒸餾水補充至10mL渣液,分別按比例往玉米芯渣液中加入內(nèi)切木聚糖酶,在設(shè)定溫度下酶解16h;取上清液測定還原糖和糠醛含量。1.4高效液相色譜法研究木寡糖和反應(yīng)物酶解產(chǎn)物木寡糖的定性采用薄層層析法:玉米芯酶解液經(jīng)煮沸滅酶、離心,取上清液點樣至硅膠板上,于V(正丁醇)∶V(冰乙酸)∶V(水)=2∶1∶1的展層液中展層3～4h,于60℃下烘干2～3h,除盡溶劑后均勻的噴上一層苯胺-二苯胺-磷酸顯色劑,于85℃下烘干10min顯色。酶解產(chǎn)物木寡糖的高效液相色譜定量檢測:儀器:Waters515型凝膠色譜儀;檢測器:Waters2410示差折光檢測器;層析柱:預(yù)填充柱RT300-7.8PolyspherCHPB(7.8×300mm,德國制造);流動相:純水;流速:0.4mL·min-1;柱溫:90℃;進樣量:50μL。1.5低聚木糖對枯草芽孢桿菌活菌數(shù)的影響試驗用枯草芽孢桿菌和乳酸桿菌由本單位篩選、分離獲得?？莶菅挎邨U菌的活化和平板計數(shù)用Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基,乳酸桿菌的活化和平板計數(shù)用deMan-Rogosa-Sharpe(MRS)培養(yǎng)基。低聚木糖對枯草芽孢桿菌的增殖作用:分別向LB液體培養(yǎng)基中添加含量為0.1%～0.5%的低聚木糖,接種1%的活化種子液,30℃、200r·min-1培養(yǎng)20h后,以不加低聚木糖為對照,用平板計數(shù)法測定活菌數(shù)。低聚木糖對乳酸桿菌的增殖作用:37℃靜止培養(yǎng)48h,用平板計數(shù)法測定活菌數(shù)。2結(jié)果與分析2.1微波消解前后木糖含量的變化微波處理時消解罐中的壓力直接關(guān)系到微波消解儀反應(yīng)罐中所能達到的溫度,而溫度是木聚糖游離速率的重要因素,微波消解時間和微波消解壓力對木聚糖的降解又有很顯著的交互作用,微波消解的強度需要嚴格控制,既要木聚糖充分的解離,還要保證木聚糖不會過度水解成木糖?？啡┦撬膺^程中木糖脫水生成的產(chǎn)物,是提取液中最主要的成色物質(zhì),也是衡量消解過程中副反應(yīng)產(chǎn)生程度的指標,糠醛含量也可以反映微波消解過程中木糖的產(chǎn)生量;因此,以反應(yīng)液中還原糖和糠醛含量作為綜合反應(yīng)指標,酶解加酶量為100U·g-1,酶解時間16h。由表1可以看出:微波消解壓力在0.8MPa、微波作用15～45min時,提取液中檢測不到還原糖,經(jīng)木聚糖酶酶解后可以檢測到還原糖,而且還原糖含量相差不大,薄層層析結(jié)果顯示酶解前提取液中無低聚糖產(chǎn)生;當微波壓力升至2.0MPa、微波作用僅3min時,提取液在酶解前就有大量還原糖產(chǎn)生,經(jīng)薄層層析,有大量的木糖產(chǎn)生,而且糠醛質(zhì)量濃度較高,達到0.675g·L-1,說明玉米芯中的木聚糖已過度水解。在微波消解儀作用下,低壓長時間與高壓短時間可以達到相同的實驗結(jié)果。以酶解前后樣品中還原糖含量之差為主要指標,糠醛含量為次要指標,選出5、7和13號酶解樣品進行高效液相色譜分析,結(jié)果(表2)顯示,7號樣品低聚木糖質(zhì)量濃度最高,達到(6.641±0.13)g·L-1,低聚木糖含量為81.43%,而5號樣品低聚木糖含量最高,為82.31%,低聚木糖濃度為(6.309±0.11)g·L-1,13號樣品木糖質(zhì)量濃度最高,且顯著高于5號和7號樣品,達到(3.609±0.07)g·L-1,而且測定的還原糖質(zhì)量濃度也為最高,達到(8.841±0.14)g·L-1,低聚木糖質(zhì)量濃度僅為(5.441±0.14)g·L-1。按照微波消解規(guī)律,在2.0MPa下作用更短的時間(少于3min),也會降低木糖的質(zhì)量濃度,但鑒于微波消解儀的壓力上升需要一定的時間,綜合酶解前后還原糖含量和糠醛含量指標,以及低聚木糖的質(zhì)量濃度,選定微波消解壓力1.6MPa,微波作用時間5min,此時微波作用后提取液中僅有少量還原糖(0.512g·L-1),酶解后還原糖含量達到6.309g·L-1,且糠醛含量較低(0.159g·L-1)。薄層層析顯示,酶解液中的主要成分為木二糖,伴有少量的木糖、木三糖和其他低聚糖(圖1)。2.2木聚糖最佳發(fā)酵溫度木聚糖降解時,起主要作用的酶是β-D-1,4內(nèi)切木聚糖酶和β-D-1,4外切木糖苷酶,β-D-1,4內(nèi)切木聚糖酶的最適pH為4.0～5.0,木糖苷酶的最適pH為3.0～4.0,在pH4.0時木糖的得率最高,在pH7.0時木糖得率最低,而在pH5.0時低聚木糖得率較高,因此,一般制備低聚木糖的pH選在5.0～6.0較為適宜。Jeong等研究表明,利用枯草芽孢桿菌內(nèi)切木聚糖酶制備木二糖時,在溫度低于60℃時,木二糖產(chǎn)量最高;Yang等研究的玉米芯木聚糖生產(chǎn)木寡糖的最適溫度為50℃。本文研究了pH4.0～7.0和溫度40～60℃下木聚糖酶對玉米芯低聚木糖生產(chǎn)的影響。表3為實驗設(shè)計表頭。由表4可見,在不同pH和不同溫度酶解條件下,酶解樣品中低聚木糖含量從高到低依次是C3、A3、B4、C7和B3,而低聚木糖所占百分比從高到低依次是C3、B1、B7、B2、B3和A3,在實驗的每個溫度條件下,3號樣品即pH5.0條件下無論是低聚木糖含量還是低聚木糖所占百分比都較其他pH條件下高,綜合比較低聚木糖含量和低聚木糖所占百分比,C3樣品中低聚木糖達到9.74g·L-1,低聚木糖所占百分比為88.0%,此時對應(yīng)的酶解pH和酶解溫度分別為pH5.0和60℃。由于60℃達到了本次試驗溫度設(shè)計的頂點,因此進一步試驗了pH5.0、65℃時低聚木糖的生產(chǎn),見表4最下列的D3。D3無論是低聚木糖質(zhì)量濃度還是低聚木糖含量都低于C3,因此將C3作為低聚木糖生產(chǎn)的優(yōu)化條件,即pH5.0和溫度60℃。2.3酶解時間對低聚木糖的影響將經(jīng)過微波消解壓力1.6MPa、微波作用時間5min的玉米芯中加入適量的木聚糖酶提取液(加酶量以每g玉米芯中加入的木聚糖酶酶活力單位計),至60℃水浴酶解8h。結(jié)果(表5)顯示,當加酶量為80U·g-1時,低聚木糖的質(zhì)量濃度為(5.21±0.07)g·L-1,加酶量達到140U·g-1時,低聚木糖的濃度快速上升至(10.53±0.14)g·L-1,而隨著加酶量的進一步增大,低聚木糖的濃度上升不明顯,因此木聚糖酶量在140U·g-1時就可以滿足低聚木糖的生產(chǎn),此時酶解樣品中低聚木糖含量為81.3%。表6考察了酶解時間對低聚木糖生產(chǎn)的影響。酶解時間為6h時,樣品液中低聚木糖的濃度達到最高值11.02g·L-1。在酶解2h時,酶解液中低聚木糖含量為83.0%,濃度為7.21g·L-1,隨著酶解時間的延長,低聚木糖的含量先是上升,4h后低聚木糖的含量開始下降,而木糖濃度和含量則隨著酶解時間的延長而上升。說明水解剛開始時,由于木聚糖底物濃度高,內(nèi)切木聚糖酶顯示了較高的活力,隨著酶解時間的延長低聚糖濃度不斷升高,外切木聚糖酶活性得到激發(fā),而內(nèi)切木聚糖酶活性則受到抑制。2.4低聚木糖添加量對枯草芽孢桿菌生長的影響將實驗室獲得的低聚木糖液體樣品噴霧干燥,得到低聚木糖粉末,進行益生菌的體外增殖實驗。結(jié)果(圖2)表明:枯草芽孢桿菌和乳酸桿菌在添加了一定量的低聚木糖后,菌落數(shù)都呈先上升后下降的趨勢;枯草芽孢桿菌在低聚木糖添加量為0.4%時菌落數(shù)達到最高值2.48×108CFU·mL-1,不加低聚木糖時菌落數(shù)為1.35×108CFU·mL-1,增殖作用達到183%,之后增殖作用開始降低,當大量添加時反而抑制枯草芽孢桿菌的生長;乳酸桿菌在低聚木糖添加量為0.2%時菌落數(shù)達到最高值2.80×109CFU·mL-1,不加低聚木糖時菌落數(shù)為0.90×109CFU·mL-1,增殖作用達到311%。3低聚木糖的提取應(yīng)用高效液相色譜分析,以低聚木糖的得率為主體評價指標,得到了玉米芯酶法制備低聚木糖的最佳工藝條件為微波處理壓力1.6MPa,微波處理時間5min,木聚糖酶用量140U·g-1,酶解時間6h,玉米芯酶解液中的低聚木糖質(zhì)量濃度可以達到11.02g·L-1。對益生菌的體外增殖實驗表明,低聚木糖添加量在0.2%和0.4%時分別可以對乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌起到最好的增殖作用,添加量進一步提高反而會抑制這2種菌的生長。本次試驗玉米芯中低聚木糖的提取,采用的是堿法預(yù)處理玉米芯微波消解后酶法降解工藝。其中評價低聚木糖生產(chǎn)的適宜條