糖尿病模型小鼠血糖變化與腸道菌群關(guān)系的研究

糖尿病模型小鼠血糖變化與腸道菌群關(guān)系的研究

腸道中的大多數(shù)微生物都在人體。乳酸桿菌和雙歧桿菌是腸道內(nèi)正常微生物群系中重要成員并與宿主終身相伴。腸道菌群可發(fā)揮特異性免疫功能,促進(jìn)宿主B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的能力;合成多種維生素,促進(jìn)機(jī)體對(duì)蛋白質(zhì)的消化、吸收;促進(jìn)機(jī)體對(duì)鈣、鐵、維生素D的吸收等生理功能。目前在研究糖尿病發(fā)生,發(fā)展時(shí),對(duì)于正常菌群的多樣性和生理功能在維持機(jī)體血糖中的作用,以及腸道菌群與血糖值之間的相互關(guān)系的研究較少。為此,我們通過建立糖尿病小鼠模型,比較成模前后,以及降糖物質(zhì)作用后,血糖值和腸道內(nèi)主要微生物的變化,探討二者的關(guān)系,希望為糖尿病的控制和預(yù)防提供新的思路和理論依據(jù)。1材料和方法1.1糖試紙條和格列吡嗪片電子天平:BL310(北京奧多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);京都血糖儀(日本,ARKRAYInc.);血糖試紙條:GlucocardTMTestStripⅡ(日本,ARKRAYInc.);STZ(Sigma公司);格列吡嗪片(海南金曉制藥有限責(zé)任公司);蕃石榴葉提取液(自制);稀釋液(0.5ml,0.5%L-半胱氨酸;1.0ml,吐溫80;0.5g,酵母粉;1000ml,水;pH7.0～7.2)。1.2醫(yī)學(xué)科學(xué)中心提供40只清潔級(jí)昆明小鼠(18～22g),雄性,由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(醫(yī)動(dòng)字第24101106號(hào))。四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院屏障級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,室溫20土2℃,濕度50%～60%,自由進(jìn)水,12h光照。1.3造模、分組和給藥小鼠空腹18h,腹腔注射STZ(80mg/kg),72h后以相同劑量加強(qiáng)注射1次。以血糖值>11.1mmol/L為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。將40只小鼠隨機(jī)分為3組:第1組:10只,小鼠不經(jīng)特殊處理(蒸餾水灌胃);第2組:15只,造模成功后,用蕃石榴葉水提取液給小鼠灌胃;第3組:15只,造模成功后,用格列吡嗪片給小鼠灌胃。1.4小鼠血糖含量測定腹腔注射STZ的7d測定血糖,如造模成功(成模時(shí)),即計(jì)為1d的血糖值:禁食3～5h,取小鼠尾靜脈血,用血糖儀測血糖值;造模成功后,使用降糖物質(zhì)(以1.25g/Kg計(jì))連續(xù)灌胃25d,同前法測定25d的血糖值。同時(shí),用電子天平稱取1、5、10、15、20、25d小鼠的體重。1.5培養(yǎng)基的制備乳酸桿菌:LBS培養(yǎng)基,37℃48h燭缸培養(yǎng);雙歧桿菌:BBL培養(yǎng)基,37℃48h厭氧培養(yǎng);梭菌:TSC培養(yǎng)基,37℃48h厭氧培養(yǎng);腸球菌:疊氮鈉-結(jié)晶紫-七葉苷培養(yǎng)基,37℃48h需氧培養(yǎng);真菌:YPD培養(yǎng)基,37℃48h需氧培養(yǎng);腸桿菌:EMB培養(yǎng)基,37℃24h需氧培養(yǎng)。EMB、TSC培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司,其余培養(yǎng)基均自行配制。測定血糖值后,以無菌方法取小鼠的新鮮糞便0.1g,置于無菌試管內(nèi),按1∶10加入適量稀釋液,用無菌玻棒攪勻后,置振蕩器上充分振蕩,使其均質(zhì)化。依次進(jìn)行10倍稀釋。選擇適宜的稀釋度,滴種于培養(yǎng)基上,分別進(jìn)行需氧和厭氧培養(yǎng),最后計(jì)數(shù)菌落,結(jié)果以每克糞便中的細(xì)菌菌落數(shù)的對(duì)數(shù)值logcfu·g-1表示。1.6統(tǒng)計(jì)處理使用SPSS11.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示結(jié)果,采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。2結(jié)果2.1小鼠體重及總增加的發(fā)生率從測定體重1d(成模時(shí))開始到25d(降糖后)結(jié)束,第1組小鼠體重的總增加的較其他組明顯。第2、3組小鼠體重的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在15、20、25d,第1組與第2、3組小鼠的體重的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。(體重?cái)?shù)據(jù)略)2.2小鼠血糖值的比較第1組小鼠血糖值隨時(shí)間無明顯變化(F=1.920,P>0.05);成模時(shí),第2、3組小鼠的血糖值明顯高于第1組(P<0.05);使用降糖物質(zhì)處理后,第2、3組小鼠的血糖值比成模時(shí)顯著降低(P<0.05),但是兩種降糖物質(zhì)對(duì)小鼠血糖值的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表2。2.3大鼠腸道菌群的變化2.3.1前后與成模時(shí)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理情況除了腸桿菌外,所測小鼠其它腸道細(xì)菌數(shù)量在小鼠造模前與成模時(shí)相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.623～80.217,P<0.05)。其中乳酸桿菌、雙歧桿菌、梭菌數(shù)量減少,而腸球菌、真菌數(shù)量增加,見表3。2.3.2小鼠腸道菌群變化第1組小鼠的腸道所測菌株無顯著性變化(F=0.334～1.696,P>0.05);血糖降低后,第2、3組小鼠的腸道乳酸桿菌、雙歧桿菌、梭菌的菌數(shù)在25d恢復(fù)到了造模前的水平,而腸桿菌、腸球菌、真菌的菌數(shù)在實(shí)驗(yàn)過程中呈遞增(在25d,腸桿菌較成摸時(shí)變化明顯(F=6.069,P<0.05)),見表3。2.4經(jīng)過處理后，大鼠血糖變化與腸道菌群之間的關(guān)系2.4.1各微生物的、小值成模時(shí),血糖值升高到極大值時(shí),雙歧桿菌、乳酸桿菌、梭菌的數(shù)量達(dá)極小值,真菌、腸球菌、腸桿菌反而增加;經(jīng)降糖物質(zhì)處理后,血糖值降低,雙歧桿菌、乳酸桿菌、梭菌的數(shù)量恢復(fù)到造模前的水平,真菌、腸球菌、腸桿菌則繼續(xù)增加,見圖1。2.4.2格列吡咯處理后的情況所測各菌種菌數(shù)的變化情況同2.4.1,見圖2。3降糖藥的使用效果STZ能抑制體內(nèi)胰島素水平,使維持血糖平衡的能力顯著降低,與非胰島素依賴型糖尿病病人高血糖值情況相似。小鼠成模后出現(xiàn)明顯“三多一少”和血糖值升高的現(xiàn)象,模型成功模擬了人類糖尿病的發(fā)病規(guī)律。本次試驗(yàn)第2、3組體重比第1組體重明顯偏低,血糖值均大于11.1mmol/L,說明造模是成功的。據(jù)資料報(bào)道,蕃石榴葉可以除異味,常被人們作為“糖尿”病者日常保健飲料。通過實(shí)驗(yàn)比較蕃石榴葉水提取液、65%醇提取液、95%醇提取液,發(fā)現(xiàn)蕃石榴葉水提取液對(duì)糖尿病模型小鼠的降糖效果好。格列吡嗪作為治療糖尿病的輔助措施,屬于第二代磺酰脲類口服降血糖值藥,不良反應(yīng)常為胃腸道癥狀(如:惡心、上腹?jié)q滿)及頭痛等。采用格列吡嗪與蕃石榴葉水提取液作為不同降糖物質(zhì)代表,通過它們的降血糖作用來研究血糖與腸道菌群的關(guān)系,未查見相關(guān)報(bào)道說明它們直接對(duì)腸道菌群產(chǎn)生影響。但本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同的降糖物質(zhì)均可使小鼠血糖值和益生菌趨于正常。是否可通過改變益生菌的變化,作為治療糖尿病的手段有待進(jìn)一步深入研究。雙歧桿菌直接或間接影響著人和動(dòng)物的生理變化和免疫功能,它在機(jī)體內(nèi)的有無或多寡是衡量健康狀況的指標(biāo)之一。乳酸桿菌可減少或消除體內(nèi)毒素和致癌物質(zhì),保護(hù)胃腸粘膜,預(yù)防便秘,預(yù)防和治療腹瀉等。單核/巨噬細(xì)胞、激活的T、B淋巴細(xì)胞表面有胰島素受體。外源性微生物侵入體內(nèi)后,免疫系統(tǒng)把信息傳遞給大腦和神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng),從而進(jìn)行調(diào)節(jié)。有文章報(bào)道,利用雙歧桿菌,乳酸桿菌或它們的制劑,可以使腸道內(nèi)益生菌增加,對(duì)小鼠腸道菌群失調(diào)的恢復(fù)具有調(diào)整作用。所以,糖尿病病人可以在使用降糖藥物的同時(shí),可以通過調(diào)整腸內(nèi)菌群來鞏固和提高療效,增強(qiáng)免疫力,減少并發(fā)癥。小鼠血糖與腸道菌群逐漸趨于正常,主要表現(xiàn)是血糖值得到控制和雙歧桿菌、乳酸桿菌等益生菌的數(shù)量恢復(fù)到正常范圍。某些條件致病菌,如大腸桿菌、腸球菌、真菌等,亦呈遞增的趨勢,與血糖變化趨勢不明顯。這可能與大腸桿菌、腸球菌、真菌易耐藥和供給小鼠的食料的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)失調(diào)或不良等因素有關(guān)。飼料中如沒有維生素K(可導(dǎo)致小鼠患有出血性綜合癥),大腸桿菌就能夠合成維生素K,這是其可能遞增的原因。研究發(fā)現(xiàn),無論病人或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物,在腸道內(nèi)或其他部位的腸球菌的數(shù)量會(huì)因抗生素使用而增加。但是,需要進(jìn)一步論證當(dāng)血糖穩(wěn)定到正常值時(shí),條件致病菌是否也應(yīng)恢復(fù)到正常范圍。腸道菌群能夠提供宿主營養(yǎng),參與宿主免疫調(diào)節(jié),具有生物拮抗等作用。雙歧桿菌、乳桿菌等能夠產(chǎn)生乳酸,在一定程度上抑制病原菌,但在腸道內(nèi)繁殖速度較慢,而腸桿菌、腸球菌、真菌在腸道內(nèi)繁殖速度較快,當(dāng)體內(nèi)的優(yōu)勢菌群(雙歧桿菌、乳桿菌等)生長受到抑制或生長緩慢時(shí),它們占據(jù)主導(dǎo)地位。當(dāng)血糖值偏高時(shí),益生菌、梭菌等偏低。降糖處理后,血糖降低,益生菌、梭菌等趨于正常水平,從而表現(xiàn)出益生菌、梭菌等腸道菌群的變化趨勢與血糖變化呈負(fù)相關(guān)。說明在疾病發(fā)生發(fā)展過程中,機(jī)體的微生態(tài)平衡也發(fā)生相應(yīng)的調(diào)整,因此,通過對(duì)腸道益生菌和條件致病菌進(jìn)行人為的控制,是否能夠預(yù)防和輔助治療糖尿病,需進(jìn)一步研究證實(shí)。STZ是一種抗菌素,有腹瀉、消