苦木提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞hepg-2的生長(zhǎng)抑制作用

苦木提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞hepg-2的生長(zhǎng)抑制作用

肝癌是中國(guó)常見(jiàn)的腫瘤之一。這是中國(guó)第二腫瘤的“殺手”，也很常見(jiàn)于中年男性。因其治療難度大,患者生存時(shí)間短,故人稱(chēng)“癌中之王”。眾所周知,天然產(chǎn)物也是抗癌藥物的重要來(lái)源,我國(guó)已有數(shù)千年使用中草藥治療腫瘤疾病的歷史,早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中已有腫瘤的記載。目前已報(bào)道有抗腫瘤活性的植物超過(guò)400種,從20世紀(jì)40年代起到2006年6月,全球應(yīng)用的175種抗癌藥物中,有57%直接或間接來(lái)源于天然產(chǎn)物。而且我國(guó)地域遼闊,各地氣候差異懸殊,植物資源豐富,種類(lèi)繁多,從中篩選出新型高活性抗腫瘤化合物具有極大優(yōu)勢(shì)?？嗄綶Picrasmaquassiodes(D.Don)Ben]為苦木科苦木屬植物,為我國(guó)南方民間常用藥。該藥的性味苦寒,有小毒,具有清熱燥濕、解毒等功效。臨床上多用于抗感染、降血壓等方面。該科植物所含化學(xué)成分主要為苦木苦味素(Quassinoids)和生物堿,其次為三萜、甾醇、皂苷、香豆素、醌類(lèi)等?？辔端囟酁樗沫h(huán)三萜內(nèi)酯及五環(huán)三萜內(nèi)酯,是該科的特征性成分,有解熱、驅(qū)蟲(chóng)、治阿米巴痢疾及殺蟲(chóng)作用。近期研究表明,苦木科植物中所含的苦木苦味素類(lèi)成分具有顯著的抗癌活性,備受人們關(guān)注,但其抗癌作用機(jī)理的研究目前確卻少有報(bào)道。本研究選用富含此類(lèi)成分的中藥苦木進(jìn)行考察,采用乙醇回流提取,觀察提取物對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞株增殖的影響,以期從中挖掘干預(yù)肝癌生長(zhǎng)的中藥活性成分,為中藥研究提供相應(yīng)的物質(zhì)和理論基礎(chǔ),以探討中藥苦木對(duì)人肝癌細(xì)胞的作用機(jī)制。1材料和機(jī)器1.1細(xì)胞植物人肝癌細(xì)胞HepG-2,購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所細(xì)胞中心。1.2血清mtt苦木,購(gòu)自北京利君堂藥店,貨號(hào)070611;高糖DMEM培養(yǎng)基,胎牛血清(美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品);四甲基二氮唑藍(lán)(MTT,北京索來(lái)寶科技有限公司);二甲基亞砜(北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司,分析純),TUNEL試劑盒(編號(hào)XS-1221)購(gòu)自于北京中昊時(shí)代生物技術(shù)中心。1.3碳培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)和細(xì)胞培養(yǎng)瓶BIO-RAD550型酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-RAD伯樂(lè)公司產(chǎn)品);3111型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)ThermoForma公司產(chǎn)品);超凈工作臺(tái)(北京昌平長(zhǎng)城空氣凈化工程公司產(chǎn)品);細(xì)胞培養(yǎng)瓶,96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國(guó)Corning/Costar產(chǎn)品);倒置顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠(chǎng));十萬(wàn)分之一天平(德國(guó)賽多利斯產(chǎn)品)。2細(xì)胞凋亡dmem的檢測(cè)2.1細(xì)胞培養(yǎng)將HepG-2細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)基為DMEM(含100mL/L胎牛血清,青霉素100U/mL和鏈霉素100μg/mL),置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱,相對(duì)飽和濕度的條件下培養(yǎng)。在細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后,在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加0.25%胰酶,37℃消化3～5min,1∶3傳代,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱,相對(duì)飽和濕度的條件下繼續(xù)培養(yǎng);隔日換液,3～5d長(zhǎng)滿(mǎn)。2.2苦木提取物的制備取苦木200g,將其與95%乙醇按質(zhì)量以1∶3)混合后80℃回流提取3h,抽濾,收集提取液?；亓魈崛?次,將所得的提取液合并后進(jìn)行真空減壓濃縮、真空干燥至恒重,得到提取物。2.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞HepG-2用0.25%的胰蛋白酶消化,配成5.0×104/mL細(xì)胞懸液,再將其接種至96孔培養(yǎng)板中,每孔200μL,于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h;待細(xì)胞完全貼壁后,實(shí)驗(yàn)組每孔加入含不同濃度(6.25、12.5、12.5、25、50、100μg/mL)苦木提取物的DMEM培養(yǎng)液200μL,對(duì)照組加入含等體積藥物溶劑的DMEM培養(yǎng)液200μL;另單設(shè)不含細(xì)胞的200μLDMEM培養(yǎng)液為空白對(duì)照組;各濃度及時(shí)間均設(shè)3個(gè)平行孔,培養(yǎng)24、48、72h后各孔分別加入20μL5g/L的四甲基偶氮唑鹽(MTT)溶液,再培養(yǎng)4h后,傾去各孔培養(yǎng)液,各孔加入200μLDMSO,15min后用酶標(biāo)儀在490nm下測(cè)定各孔光密度D(λ)值,計(jì)算藥物各濃度對(duì)HepG-2細(xì)胞的抑制率,并計(jì)算增殖抑制率,并以L(fǎng)OGIT法來(lái)計(jì)算IC50。抑制率(%)=1-D(λ)實(shí)驗(yàn)組-D(λ)空白組D(λ)對(duì)照組-D(λ)空白組×100%(%)=1?D(λ)實(shí)驗(yàn)組?D(λ)空白組D(λ)對(duì)照組?D(λ)空白組×100%2.4TUNEL法檢測(cè)凋亡細(xì)胞將濃度為5×104/mL的HepG-2細(xì)胞接種于經(jīng)多聚賴(lài)氨酸包被的清凈的蓋玻片上,用DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2條件下在6孔板中培養(yǎng)24h后,每孔加入不同濃度的苦木提取物(72h的IC50,50μg/mL),72h后取出蓋玻片,PBS沖洗3次。0.1%Triton-100破膜,4%多聚甲醛固定,H2O2阻斷。用TDT法將生物素標(biāo)記的d-UTP在末端轉(zhuǎn)移酶的作用下,標(biāo)記到DNA的5′端缺口上,再用親和素標(biāo)記的HRP與之結(jié)合,然后加人底物DAB顯色,甲基綠復(fù)染,從而使細(xì)胞核呈現(xiàn)棕褐色,未凋亡細(xì)胞核呈藍(lán)綠色。隨機(jī)觀察5個(gè)視野,每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞,按下式計(jì)算細(xì)胞凋亡率:細(xì)胞凋亡率/%=凋亡細(xì)胞細(xì)胞總數(shù)×100%/%=凋亡細(xì)胞細(xì)胞總數(shù)×100%2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)均以ˉx±sxˉ±s表示,用生物統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0對(duì)各個(gè)組進(jìn)行單因素方差分析來(lái)比較組間差異;以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3結(jié)果3.1中藥苦木醇提物對(duì)人肺癌細(xì)胞hepg-2的抑制作用苦木提取物在不同時(shí)間及不同濃度下對(duì)HepG-2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制結(jié)果如表1所示,不同濃度(6.25～100μg/mL)的中藥苦木提取物在連續(xù)處理HepG-2細(xì)胞72h后,各劑量藥物組的D(λ)值都隨著藥物濃度的升高而顯著降低。表明苦木提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG-2生長(zhǎng)具有抑制作用,且呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。苦木提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG-2的生長(zhǎng)抑制作用隨著藥物濃度的升高而增強(qiáng)的同時(shí),其抑制效果也與作用時(shí)間呈正相關(guān)。當(dāng)苦木提取物的作用濃度為6.25μg/mL作用24h時(shí)無(wú)任何的抑制作用,而當(dāng)作用時(shí)間延長(zhǎng)到48、72h時(shí),對(duì)細(xì)胞的抑制率分別增長(zhǎng)到了9.8%和9.9%;當(dāng)苦木提取物的作用濃度為100μg/mL,在作用時(shí)間分別為24、48、72h時(shí),可使85%以上的細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。苦木提取物作用HepG-2細(xì)胞72h的IC50為19.51μg/mL,其作為植物粗提物的IC50<20μg/mL,并且有細(xì)胞毒性的劑量依賴(lài)性關(guān)系,其最高抑制率達(dá)到了90%以上,則判定苦木的醇提物在體外對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG-2有抑制作用。各個(gè)劑量的中藥苦木提取物作用人肝癌細(xì)胞HepG-2以后,細(xì)胞的增殖速度顯著減緩,對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用隨著藥物濃度的升高和藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增強(qiáng)且呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,苦木提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制呈現(xiàn)濃度和時(shí)間的依賴(lài)性。3.2苦木提取物對(duì)hepg-2細(xì)胞凋亡的影響當(dāng)用19.51μg/mL(IC50)的苦木提取物處理HepG-2細(xì)胞72h時(shí),可見(jiàn)有一定數(shù)量的凋亡體積顯著縮小,細(xì)胞變圓,核染色質(zhì)濃縮,凋亡率為40.6%;當(dāng)提高濃度到50μg/mL處理HepG-2細(xì)胞72h時(shí)可見(jiàn)凋亡細(xì)胞的數(shù)量顯著增多,凋亡率為59.8%;而對(duì)照組,未見(jiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象。見(jiàn)圖1。由圖可見(jiàn),對(duì)照組HepG-2細(xì)胞72h后,未見(jiàn)顯著凋亡,細(xì)胞分布均勻,大小正常,胞核綠染?？嗄咎崛∥颕C50實(shí)驗(yàn)組苦木提取物作用于HepG-2細(xì)胞72h后,部分凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)棕褐色?？嗄咎崛∥?0μg/mL實(shí)驗(yàn)組苦木提取物作用于HepG-2細(xì)胞72h后,細(xì)胞數(shù)量減少,出現(xiàn)大部分凋亡細(xì)胞,胞核呈現(xiàn)棕褐色。表明苦木提取物具有誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞凋亡的作用。4苦木提取物體外作用對(duì)人肺癌細(xì)胞hepg-2增殖的影響腫瘤是危及人類(lèi)生命的首要頑疾,藥物治療為中西醫(yī)腫瘤治療中的一個(gè)重要模式。中醫(yī)藥的抗腫瘤作用已得到廣泛的肯定,其機(jī)制有多方面,如抑制DNA合成、抑制腫瘤血管形成、誘導(dǎo)細(xì)胞分化、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、抑制蛋白酪氨酸激酶(proteintyrosinekinase,PTK)活性等。目前,抗腫瘤藥物按其來(lái)源大致可以分為:化學(xué)合成藥物、植物來(lái)源藥物、微生物來(lái)源藥物(抗腫瘤抗生素)和生物技術(shù)藥物,其中來(lái)源于天然植物的藥物在抗癌藥物領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。目前對(duì)苦木的研究表明其富含苦木味素類(lèi)活性成分。Shinsaku等已發(fā)現(xiàn)苦木中的3種成分對(duì)P388白血病細(xì)胞有抑制活性。但是苦木對(duì)肝癌的生長(zhǎng)干預(yù)未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用MTT法檢測(cè)了不同濃度的苦木提取物不同時(shí)段體外對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG-2增殖的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:苦木提取物對(duì)細(xì)胞的最大無(wú)毒濃度為6.25μg/mL;與對(duì)照組比較,50、100μg/mL劑量組對(duì)HepG-2細(xì)胞的增殖有顯著的抑制作用(P<0.05),并且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng),抑制效果更加顯著,呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。同時(shí)采用TUNEL法證明,苦木的提取物作用細(xì)胞72h后,顯示出顯著的凋亡特征;且隨著苦木提取物作用濃度的增加,凋亡細(xì)胞的數(shù)目也會(huì)隨之增多?？梢?jiàn),苦木提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG-2細(xì)胞有顯著的抑制作用,其抑制作用與劑量及作用時(shí)間呈正相關(guān),細(xì)胞凋亡是殺滅腫瘤細(xì)胞的主要途徑,本研究顯示苦木提取物能誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞發(fā)生凋亡,但高劑量的藥物作