分子標(biāo)記在煙草遺傳育種中的應(yīng)用

分子標(biāo)記在煙草遺傳育種中的應(yīng)用

自20世紀(jì)80年代以來，隨著分子雜交、pcr和dna序列快速分析等生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)的建立，人們可以更容易地分析和檢測(cè)遺傳物質(zhì)dna的多態(tài)性，并產(chǎn)生基于dna多態(tài)性的各種分子標(biāo)記。與其他類型的遺傳標(biāo)記相比,分子標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)非常明顯:(1)直接以DNA的形式表現(xiàn),在植物體的各個(gè)組織、各發(fā)育時(shí)期均可檢測(cè)到,不受季節(jié)、環(huán)境限制,不存在表達(dá)與否的問題;(2)數(shù)量極多,遍及整個(gè)基因組;(3)多態(tài)性高,自然存在著許多等位變異,不需專門創(chuàng)造特殊的遺傳材料;(4)表現(xiàn)為中性,即不影響目標(biāo)性狀的表達(dá),與不良性狀無必然的連鎖;(5)有許多分子標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性,能夠鑒別出純合基因型與雜合基因型,提供完整的遺傳信息。傳統(tǒng)的煙草育種主要是通過常規(guī)雜交的方法,根據(jù)分離群體的形態(tài)表現(xiàn)和育種者的經(jīng)驗(yàn)等進(jìn)行累代選擇,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)性狀的改良。而基因的表達(dá)往往受環(huán)境的影響,且多數(shù)情況下難以找到與目標(biāo)基因相連鎖的形態(tài)標(biāo)記,所以傳統(tǒng)的育種手段對(duì)目標(biāo)性狀的改良常常耗時(shí)、費(fèi)力、效率不高。分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展為解決這一問題開創(chuàng)了新的途徑。1草資源研究中的分子標(biāo)記1.1rapd擴(kuò)增鑒定遺傳標(biāo)記在種質(zhì)資源研究中的重要用途之一就是繪制品種(品系)的指紋圖譜。梁明山等采用水平切片聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測(cè)了7種同工酶的酶譜圖式,篩選出的酯酶同工酶聚丙烯酰胺凝膠電泳酶譜(EST)可作為K326、云煙85、RG11、Val16、RG17、V2、云煙317、6465、紅花大金元、NC82等10個(gè)煙草品種鑒定的同工酶指紋圖譜;另外,K326、云煙85、RG11、V2、云煙317、6465、紅花大金元、NC82種子的水溶蛋白SDS、IEF圖譜可以作為鑒定這8個(gè)品種的蛋白質(zhì)指紋圖譜。FilippisLde等研究指出,利用形態(tài)標(biāo)記和傳統(tǒng)的生物學(xué)方法不能區(qū)分普通煙草或黃花煙草及它們的雜種,利用RAPD標(biāo)記技術(shù)則可以將其區(qū)別開來。JCCoussirat等用160個(gè)引物對(duì)32個(gè)煙草材料的基因組DNA進(jìn)行了RAPD分析,其中9個(gè)引物可以產(chǎn)生29條多態(tài)性帶;通過聚類分析,可以把不同工業(yè)類型的烤煙、白肋和深色煙聚到不同的類群里,這為煙草種質(zhì)資源的收集和育種提供了理論依據(jù)和技術(shù)支持。常愛霞等利用RAPD技術(shù)從500個(gè)引物中篩選出4個(gè)多態(tài)性引物,這4個(gè)引物擴(kuò)增出的多態(tài)性片段可以作為鑒定大白筋599和G28兩個(gè)品種的分子標(biāo)記。LucaRossi等利用6對(duì)AFLP引物組合,在煙草品種K326、TN90、TN86和Samsun中擴(kuò)增出了33個(gè)多態(tài)性標(biāo)記。這些多態(tài)性標(biāo)記可以很容易地將上述品種區(qū)分開來。對(duì)于像K326和TN90這樣的煙草品種,即使是用調(diào)制后的煙葉作為材料,這些多態(tài)性標(biāo)記仍可以將它們鑒別出來。1.2煙草種質(zhì)資源的多樣性姬廣海等研究指出,遺傳多樣性是生物多樣性研究的核心,它可反映出物種的遺傳背景、育種潛力和利用價(jià)值,遺傳多樣性研究對(duì)優(yōu)異種質(zhì)的保護(hù)和發(fā)掘利用具有重要意義。NRen,MPTimko等利用AFLP標(biāo)記技術(shù)對(duì)46個(gè)煙草栽培種和7個(gè)煙草野生種進(jìn)行遺傳多樣性分析,結(jié)果表明,利用AFLP技術(shù)結(jié)合地理來源和調(diào)制類型可以將46個(gè)栽培種分為6類,栽培種的遺傳多樣性低,而7個(gè)野生種的遺傳多樣性比較豐富;另外,多態(tài)性譜帶顯示,普通煙草栽培種中都至少具有N.sylvestris、N.tomentosiformis或N.otophora的一個(gè)特征譜帶,這表明普通煙草N.tabacum的起源與這3個(gè)野生種有關(guān)。許明輝等對(duì)來源于中國(guó)、美國(guó)等國(guó)家的23個(gè)烤煙和地方曬晾煙品種進(jìn)行了RAPD分析,并將其劃分為6類,各類中包含有不同地理來源和不同調(diào)制類型的品種,這與以往人們對(duì)這些品種的認(rèn)識(shí)有一定的不同,說明品種地理來源和調(diào)制類型差異與遺傳差異沒有必然的聯(lián)系。因此育種實(shí)踐中親本選配時(shí)不僅要考慮雙親的地理來源、調(diào)制類型,同時(shí)也應(yīng)考慮親本的系譜、遺傳差異等。王志德等對(duì)24個(gè)不同類型煙草核心種質(zhì)進(jìn)行了RAPD分析,結(jié)果表明,種質(zhì)間的遺傳差異并不完全取決于栽培類型間的差異,而與種質(zhì)間演化關(guān)系有關(guān)。王濤等利用RAPD和ISSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)30份煙草種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析,研究顯示,野生種和栽培種之間存在較大遺傳差異;親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近與其遺傳相似性有關(guān),而與煙草栽培種的調(diào)制類型差異無關(guān)。這與許明輝等和王志德等的研究結(jié)果一致。楊本超等利用ISSR和IRAP技術(shù)對(duì)119份煙草種質(zhì)資源進(jìn)行了多樣性研究,結(jié)果指出在各種煙草類型中野生煙的平均雜合度和多態(tài)性位點(diǎn)率最高,香料煙最小;從總體上來看,除黃花煙與其他各類型的遺傳距離較遠(yuǎn)外,我國(guó)煙草各類型間遺傳一致性較高,遺傳多樣性較低,遺傳基礎(chǔ)狹隘。2該菌株在草抗病性育種中的應(yīng)用2.1優(yōu)化植物的抗病品種目前,危害煙草的病毒病主要是煙草普通花葉病(TMV)、黃瓜花葉病(CMV)、煙草蝕紋病(TEV)、馬鈴薯Y病(PVY)、煙草環(huán)斑病(TRSV)。其中煙草普通花葉病、黃瓜花葉病和馬鈴薯Y病是當(dāng)前生產(chǎn)上發(fā)病率較高、造成損失較大的3種病害。1985年,Sanford和Johnston提出病原體引發(fā)抗性(Pathogen-derivedresistance,PDR)的概念。1986年,PowellAbel等將煙草花葉病毒(TMV)的外殼蛋白基因?qū)霟煵?獲得第一例抗TMV轉(zhuǎn)基因植株。自此以后,植物抗病毒基因工程獲得迅速發(fā)展,已成為解決植物抗病毒病害的主要手段。植物抗病毒基因工程研究主要包括2個(gè)方向,其中一個(gè)方向是將病毒本身的基因?qū)胧荏w植物,獲得抗性植株;另一個(gè)方向是將非病毒來源的基因,如植物中自然存在的抗性基因或植物、微生物的核糖體失活蛋白(RIPs)基因等導(dǎo)入受體植物,獲得抗病毒植株。美國(guó)KoellentG等研究表明,煙草PVY抗源主要集中在栽培品種VirginA的突變體VirginAMutant(TI1406)上,其對(duì)PVY的抗性被認(rèn)為由隱性單基因(va,va1,va2等)控制,抗PVYO(commonstrains)普通株系。另一個(gè)栽培品種Enshu(TI1586)抗PVY的弱毒株系,但對(duì)其強(qiáng)毒株系不抗。SNoguchi等對(duì)感PVY品種BY4及其近等基因系F55進(jìn)行RAPD分析,利用篩選出的多態(tài)性引物對(duì)其F2群體進(jìn)行分析,找到了10個(gè)RAPD標(biāo)記,遺憾的是這些標(biāo)記只在感病品種中存在,在抗病品種中不存在。Southern雜交也證實(shí)了這些標(biāo)記的序列在抗病品種中不存在,而存在于感病品種中,從而認(rèn)為va基因位點(diǎn)的抗性是由于對(duì)PVY感病基因Va位點(diǎn)的缺失。通過在植物體內(nèi)表達(dá)馬鈴薯Y病毒屬基因組序列如P1、P3、CI、VPg、NIa、NIb、CP等,目前人們已獲得了多種抗病毒的轉(zhuǎn)基因植物。白慶榮等將非翻譯馬鈴薯X病毒的衣殼蛋白(PVX-CP)基因和非翻譯馬鈴薯Y病毒的外殼蛋白(PVY-CP)基因組成嵌合基因,構(gòu)建植物表達(dá)載體pROKXY,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草NC89,獲得6株對(duì)PVX和PVY的混合侵染表現(xiàn)為免疫的轉(zhuǎn)基因植株。分子分析表明,這種抗性為RNA介導(dǎo)的病毒抗性。張凱等將煙草普通花葉病TMV的部分運(yùn)動(dòng)蛋白基因通過農(nóng)桿菌借導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草品種云煙87,獲得了50株轉(zhuǎn)基因煙草,PCR和Southern分析表明基因已整合到煙草植株的基因組內(nèi)。轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)TMV的抗性包括3種類型:免疫型5株,抗病性2株,感病性43株。2.2煙草抗真菌病近年來,煙草真菌、細(xì)菌性病害對(duì)煙葉生產(chǎn)的危害越來越嚴(yán)重,與抗病毒病研究相比,煙草抗真菌、細(xì)菌性病害研究要落后的多,但也取得了一定的進(jìn)展。2.2.1抗根黑腐病基因的擴(kuò)增煙草根黑腐病是一種普遍的土壤真菌性病害,在煙草栽培種中有些材料只對(duì)該病有部分抗性,而煙草的近緣四倍體N.debneyi對(duì)根黑腐病具有廣譜抗性。BaiD等對(duì)N.debneyi和普通煙草Delgold創(chuàng)造的抗根黑腐病的二體和單體異附加系進(jìn)行了RAPD分析,結(jié)果顯示,帶有抗病基因的染色體是來自N.debneyi;然而,大多數(shù)情況下,普通煙草的遺傳背景明顯阻礙了同源染色體的配對(duì),這也引起染色體聯(lián)會(huì)的消失,但有時(shí)來自于N.debneyi的染色體也可以和普通煙草染色體配對(duì)。這使得將帶有抗病基因的染色體片段轉(zhuǎn)移到普通煙草,培育出抗根黑腐病品種成為可能。BaiD等利用441個(gè)引物對(duì)煙草品種Delgold和它的具有來自N.debneyi的抗根黑腐病基因的近等基因系以及抗根黑腐病品種PB19進(jìn)行了RAPD分析,發(fā)現(xiàn)標(biāo)記在Delgold和其近等基因系間的多態(tài)性比較低,最后僅找到2個(gè)與煙草根黑腐病抗性基因緊密連鎖的RAPD標(biāo)記。KenwardRD等將與該抗性基因緊密連鎖的RAPD標(biāo)記UBC4181050克隆測(cè)序,分離出了與抗性基因連鎖的標(biāo)記Tnd-1。2.2.2rapd標(biāo)記劉曉俠等通過輻射誘變獲得了高抗煙草黑脛病的突變株系,將突變抗病株系與感病品種紅花大金元進(jìn)行雜交得到F2分離群體,然后利用RAPD標(biāo)記和群體分離分析法(BSA),找到了與煙草抗黑脛病基因Bsl(t)連鎖的RAPD標(biāo)記OPT023000和OPM112500,其遺傳距離分別為20.5cM和29.9cM。JohnsonES等的RAPD分析結(jié)果表明來自白花丹葉煙草(N.plumbaginifolia)的黑脛病抗性基因和來自長(zhǎng)葉煙草(N.longiflora)的黑脛病抗性基因是等位基因,并且這2個(gè)基因位點(diǎn)能發(fā)生重組;他們用BSA法找到了與烤煙品種Coker371Gold中黑脛病抗性基因Ph連鎖的RAPD標(biāo)記,并證明所得到的標(biāo)記可以有效應(yīng)用于對(duì)Ph基因的分子標(biāo)記輔助選擇育種中。張錦偉等采用SMART技術(shù)構(gòu)建了抗黑脛病煙草品種K326的cDNA文庫(kù),為抗黑脛病基因的分離、篩選和克隆奠定了基礎(chǔ)。2.2.3白肋煙抗病品種的aflp擴(kuò)增煙草青枯病是一種嚴(yán)重危害煙草生產(chǎn)的土壤細(xì)菌性病害,在我國(guó)長(zhǎng)江以南的煙區(qū)普遍發(fā)生。人們對(duì)煙草青枯病抗性的遺傳機(jī)制進(jìn)行了較多研究,但關(guān)于該抗性基因的個(gè)數(shù),卻未形成一致意見,一種觀點(diǎn)認(rèn)為該抗性由多基因控制,另一種觀點(diǎn)認(rèn)為由顯性單基因控制。目前,根據(jù)抗性來源不同,人們將煙草青枯病抗性分成兩種情況,其中,來源于T.I.448A和DSPA的抗性是由多基因控制;而來源于SumatraC和Xanthi的抗性則是由顯性單基因控制。Matsuda認(rèn)為煙草品種Hatano,Kokubu,Odaruma和Awa具有青枯病抗性基因Rps,而品種Enshu和Hatanodaruma不但具有青枯病抗性基因Rps還具有其他抗性基因。NishiT等利用白肋煙抗病品種W6和感病品種Michinoku1配制雜交組合,進(jìn)行了AFLP分析。AFLP引物在親本間共擴(kuò)增出117條多態(tài)性帶,利用多態(tài)性引物對(duì)125個(gè)雜種一代進(jìn)行作圖,建立了包括10個(gè)連鎖群的連鎖圖譜,其中與青枯病抗性有關(guān)的一個(gè)QTL被定位在一個(gè)連鎖群上,包括15個(gè)分子標(biāo)記,長(zhǎng)32cM,此QTL對(duì)抗性的貢獻(xiàn)率為30%。楊友才等選用高感青枯病品種紅花大金元與高抗青枯病品種Ti448A配制雜交組合,依據(jù)群體分離分析法(BSA)進(jìn)行RAPD分析,從近200個(gè)隨機(jī)引物中篩選出一個(gè)多態(tài)性引物S503,實(shí)驗(yàn)證明該引物擴(kuò)增出的特異性片段S503-750是一個(gè)與抗青枯病基因連鎖的RAPD標(biāo)記,此標(biāo)記與抗性基因間的重組率為5.984%,連鎖距離為6.261cM。2.2.4rapd標(biāo)記的篩選YiYH等以白肋煙感病品種NC528和抗病品種Ky14以及烤煙感病親本Coker139和抗病親本SpeightG-28為材料,利用BSA法進(jìn)行了煙草野火病抗性基因的RAPD標(biāo)記。結(jié)果得到5個(gè)與抗性基因連鎖的RAPD標(biāo)記。徐秀紅等以含有來源于長(zhǎng)葉煙草(N.longiflora)的抗病基因的品種Ky14和感病品種SpeightG-140為親本,利用BSA法對(duì)抗病基因進(jìn)行RAPD分析。從423個(gè)引物中篩選到1個(gè)與抗病基因緊密連鎖的RAPD標(biāo)記S522000,標(biāo)記與基因間的遺傳距離為4.88cM;用標(biāo)記S522000對(duì)[(SpeightG-140×Ky14)×SpeightG-140]BC1群體進(jìn)行輔助選擇和驗(yàn)證,結(jié)果表明,這個(gè)標(biāo)記可有效用于來自長(zhǎng)葉煙草野火病抗性基因的檢測(cè)和輔助選擇。2.3栽培品種的篩選煙草抗根結(jié)線蟲病的育種始于20世紀(jì)30年代,目前已培育出一些抗病品種如NC95、NC587、SpeightG-117、SpeightG-80等,這些品種對(duì)南方根結(jié)線蟲病1號(hào)和3號(hào)小種具有抗性。目前尚沒有培育出兼抗南方根結(jié)線蟲病和爪哇根結(jié)線蟲病的栽培品種。N.repanda對(duì)爪哇根結(jié)線蟲病免疫,但是不易與紅花煙草雜交。YiYH等以抗根結(jié)線蟲病白肋煙品種NC528和感病品種Ky14為材料,利用RAPD標(biāo)記繪制了抗根結(jié)線蟲病1號(hào)和3號(hào)小種基因(Rk)的連鎖圖譜,其中16個(gè)RAPD標(biāo)記被定位在圖譜的6個(gè)位點(diǎn)上,總長(zhǎng)24.1cM,這為根結(jié)線蟲病抗性基因的克隆奠定了基礎(chǔ)。王揚(yáng)等對(duì)12個(gè)煙草品種(包括烤煙和晾曬煙)進(jìn)行RAPD分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)OPJ13能夠在烤煙、晾曬煙所有感病品種中擴(kuò)增出一條780bp的DNA片段,而在所有抗病品種的擴(kuò)增產(chǎn)物中均未發(fā)現(xiàn)該片段。由于目前抗根結(jié)線蟲病烤煙品種的抗源均來自原始抗病親本TI1706,因此OPJ13-780極有可能是與煙草感病基因相連鎖的分子標(biāo)記。3問題和期待3.1加強(qiáng)標(biāo)記應(yīng)用,提高育種效率3.1.1目前在煙草中應(yīng)用的分子標(biāo)記大部分為RAPD標(biāo)記,而近年來發(fā)展起來的新型分子標(biāo)記在煙草中的應(yīng)用較少,所以應(yīng)大力開展新型分子標(biāo)記在煙草中的應(yīng)用研究,建立并優(yōu)化相應(yīng)的分子標(biāo)記應(yīng)用體系,為煙草研究提供更為精確的遺傳標(biāo)記。3.1.2在煙草有益基因已有分子標(biāo)記中,標(biāo)記和目的基因間的遺傳距離普遍較大,難以有效應(yīng)用于育種實(shí)踐,且與目的基因完全連鎖的標(biāo)記少,影響基因檢測(cè)的準(zhǔn)確性。因此,應(yīng)進(jìn)一步篩選緊密連鎖或共分離的標(biāo)記,以準(zhǔn)確地檢測(cè)有益基因,提高育種的選擇效率。3.1.3目前各種分子標(biāo)記技術(shù)均有不同程度的缺點(diǎn),這使得大規(guī)模應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)輔助選擇育種受到一定限制,所以今后應(yīng)開發(fā)共顯性、多態(tài)性高、重復(fù)性穩(wěn)定性好、簡(jiǎn)單易用、自動(dòng)化程度高的新型理想分子標(biāo)記技術(shù),為普及應(yīng)用分子標(biāo)記輔助選擇(MAS)提供技術(shù)支持。3.2價(jià)格補(bǔ)充3.2.