乳酸菌外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)研究進(jìn)展

乳酸菌外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)研究進(jìn)展

蘑菇是一種能夠大量發(fā)酵和產(chǎn)生水楊酸的革蘭陽性細(xì)菌，包括胸骨細(xì)菌、乳酸菌和雙殼菌。乳酸菌是人和大多數(shù)動物腸道內(nèi)的常見細(xì)菌,因其在食品工業(yè)各個領(lǐng)域中的長期應(yīng)用已證明不具有致病性,被公認(rèn)為安全級(GRAS,generallyrecognizedassafe)微生物。20世紀(jì)90年代,國內(nèi)外學(xué)者開始致力于對乳酸菌分子生物學(xué)及作用機(jī)制的研究,以乳酸球菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌作為基因工程受體菌,應(yīng)用基因工程技術(shù)有目的、有選擇地研制新一代微生態(tài)制劑,以更好的控制其參與食品加工、醫(yī)療保健的過程。通過分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步為人們探索其新的應(yīng)用潛力提供了基礎(chǔ),如利用基因工程乳酸菌在生物反應(yīng)器內(nèi)發(fā)酵食品或直接在人和動物消化道內(nèi)生產(chǎn)蛋白等,其中最有前景的應(yīng)用其作為活載體將治療性蛋白或抗原傳遞至黏膜表面,繼而同時誘導(dǎo)黏膜免疫和系統(tǒng)免疫。1乳酸菌1.1乳酸球形總外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)乳酸球菌是乳酸菌中的典型菌種,其全部基因組序列已經(jīng)獲得。由這種GRAS細(xì)菌生產(chǎn)的外源蛋白可以直接應(yīng)用,從而促進(jìn)外源蛋白與環(huán)境之間的相互作用。乳酸球菌作為基因工程受體菌理想菌株有其獨(dú)特的優(yōu)勢:首先,乳酸球菌是食品級微生物,有別于沙門菌、大腸埃希菌和痘病毒等活疫苗載體,而且乳酸球菌無強(qiáng)抗原性;其次,乳酸球菌本身分泌蛋白較少,Usp45是迄今已知乳酸球菌分泌的唯一可檢測蛋白,減少了載體微生物的自身蛋白對外源分泌蛋白的干擾;第三,乳酸球菌不產(chǎn)生任何細(xì)胞外蛋白酶,不會引起分泌蛋白發(fā)生細(xì)胞外的降解。但是,乳酸球菌基本不在胃腸道內(nèi)定植,此缺點(diǎn)使其因不能長期持續(xù)分泌外源蛋白而影響免疫效果。隨著對乳酸球菌外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)研究的逐漸深入,采用組成型和誘導(dǎo)型啟動子實(shí)現(xiàn)了外源蛋白在乳酸球菌的大量表達(dá),并開發(fā)出含有不同誘導(dǎo)型啟動子的多種表達(dá)系統(tǒng),如乳糖誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)、T7啟動子的表達(dá)系統(tǒng)、噬菌體的表達(dá)系統(tǒng),通過誘導(dǎo)物、抑制物或環(huán)境因子使外源基因的表達(dá)控制在需要的范圍內(nèi)。但是,表達(dá)的外源蛋白最終會導(dǎo)致不可控制的細(xì)胞溶解,因此仍不能成為理想的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)。1996年,deRUYTER等研發(fā)出一種基于乳酸球菌nisA啟動子(由nisR和nisK組成)的可調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)(NICE-System,nisincontrolexpressionsystem)。Nisin是一種生物安全肽,在一些國家作為食品保鮮劑使用于食品工業(yè)中,Nisin調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)可以根據(jù)需要嚴(yán)格控制外源蛋白的表達(dá)量,并且其誘導(dǎo)效率可達(dá)1000倍以上。近年來由乳球菌表達(dá)的外源蛋白大多用此系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)的。與此同時,也相繼開發(fā)出一些根據(jù)環(huán)境條件如pH值,溫度或離子濃度等的調(diào)節(jié)乳球菌啟動子的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)。1.2外源蛋白的活性隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步和各種乳酸球菌外源蛋白表達(dá)載體的成功開發(fā),利用乳酸球菌表達(dá)外源蛋白已相對容易,但作為疫苗遞呈活載體,乳酸球菌以何種方式向黏膜免疫系統(tǒng)提呈抗原,如何使所表達(dá)的外源蛋白與免疫系統(tǒng)之間有效的接觸繼而誘導(dǎo)免疫反應(yīng)是一個巨大挑戰(zhàn)。外源蛋白在乳酸球菌中多數(shù)以分泌形式表達(dá),因此提高外源蛋白的分泌效率對于促進(jìn)黏膜免疫反應(yīng)是必要的。LeLOIR和RAWN等相繼開發(fā)出多種適合于乳酸球菌的信號肽系列,為探索其他外源蛋白的在乳酸菌中的大量表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)證明,來源于乳酸球菌的USP45信號肽,為目前已知提高外源蛋白分泌效率能力最高的信號肽。研究者認(rèn)為,在宿主細(xì)胞表面有效的表達(dá)外源抗原是活載體疫苗向黏膜免疫系統(tǒng)提呈抗原的最佳方式。因此對細(xì)胞表面表達(dá)系統(tǒng)的深入研究具有重大意義。RAHA等將Acma蛋白中一段255bp的具有膜結(jié)合特性的區(qū)域與腸病毒EV71的VP1蛋白A1和A3區(qū)域在乳酸球菌中進(jìn)行融合表達(dá),穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明外源蛋白在宿主細(xì)胞膜上的結(jié)合能力大為增強(qiáng)。此研究為外源蛋白在宿主細(xì)胞膜上的準(zhǔn)確穩(wěn)定表達(dá)提供了基礎(chǔ)。在乳酸球菌中表達(dá)外源抗原的工具和條件已經(jīng)相對成熟,為進(jìn)一步開發(fā)食品級的新型活黏膜疫苗提供了基礎(chǔ)。NORTON等研究發(fā)現(xiàn),給鼠口服免疫表達(dá)破傷風(fēng)毒素片段C(TTFC)的重組乳酸球菌后,IgG和IgA水平顯著提高,證實(shí)了乳酸球菌可有效提高黏膜免疫系統(tǒng)提呈抗原及誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)的能力。已有多種病原微生物抗原在乳酸球菌中得到有效表達(dá)[11,12,13,14,15,16,17,18,19,20](見表1)。2乳酸桿菌2.1乳酸桿菌的保鮮乳酸桿菌作為主要的益生菌被廣泛應(yīng)用于食品及飼料加工業(yè),在功能食品、醫(yī)療保健、微生態(tài)制劑等領(lǐng)域的應(yīng)用具有誘人的前景。目前,乳酸桿菌制劑已被應(yīng)用于腸道的微生態(tài)治療,口服乳酸桿菌能增強(qiáng)機(jī)體對抗原的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)。乳酸桿菌作為基因工程受體菌,其優(yōu)越性主要表現(xiàn)在:(1)乳酸桿菌能在呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)定植,對維持微生態(tài)平衡具有重要作用;(2)身為食品級細(xì)菌,易構(gòu)建成食品級的基因克隆及表達(dá)系統(tǒng),可以有效提高基因工程產(chǎn)品的安全性,并可在一定程度上簡化表達(dá)產(chǎn)物的后期處理工藝;(3)同腸胃外免疫途徑相比,通過黏膜免疫,可以誘發(fā)IgA產(chǎn)生;(4)具有免疫佐劑作用、固有免疫原性及對膽汁酸的抵抗力。因此,乳酸桿菌作為基因工程受體菌的應(yīng)用前景十分廣闊。2.2乳酸桿菌質(zhì)粒乳酸桿菌的許多種類中均發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒的存在,最早在1976年由CHASSY及其同事發(fā)現(xiàn)。分離得到質(zhì)粒的菌株來源于植物、肉類、青儲飼料、發(fā)酵劑及消化道。用DNA雜交和核苷酸序列分析證實(shí),各種質(zhì)粒之間具有不同程度的同源性,從而說明質(zhì)粒間的橫向傳遞和重組是相當(dāng)頻繁的。雖然質(zhì)粒普遍存在乳酸桿菌中,但對其的功能了解甚少,這一點(diǎn)不同于乳酸球菌。乳酸桿菌的大多數(shù)質(zhì)粒,尤其是小質(zhì)粒均屬隱蔽型的,但有些質(zhì)粒編碼功能已經(jīng)明確,并被應(yīng)用于乳酸桿菌的鑒定、定型、載體構(gòu)建及修飾。乳酸桿菌質(zhì)粒具有如下特點(diǎn):(1)大多數(shù)為隱蔽型質(zhì)粒;(2)乳酸桿菌質(zhì)粒具有遺傳穩(wěn)定性;(3)乳酸桿菌中小型質(zhì)?？截悢?shù)高;(4)部分乳酸桿菌質(zhì)粒復(fù)制子宿主范圍廣泛,可在其他種類的革蘭陽性菌及大腸埃希菌中發(fā)揮作用;(5)乳酸菌屬的某些菌株的質(zhì)粒也可作為乳酸桿菌的質(zhì)粒,如由宿主范圍廣的乳酸球菌質(zhì)粒pGK12構(gòu)建出的乳酸桿菌基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng);(6)某些乳酸桿菌質(zhì)粒沒有宿主特異性,如pLP501、pLPE323適用于廣泛宿主范圍,可在不同種類乳酸桿菌中增殖。表2列出了從乳酸桿菌中分離的質(zhì)粒及構(gòu)建的質(zhì)粒。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展,已分離出了乳酸桿菌的各種表達(dá)調(diào)控元件,對乳酸桿菌基因轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控及蛋白質(zhì)分泌機(jī)制有了進(jìn)一步的了解,并通過對部分質(zhì)粒DNA序列的測定,然后同已知序列質(zhì)粒的基因進(jìn)行比較來推測未知質(zhì)?；蚬δ艿耐緩?相繼開發(fā)出了乳酸桿菌的克隆載體、表達(dá)載體、整合載體。研究發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌質(zhì)粒基因中普遍存在兩種調(diào)控序列,一種是與基因復(fù)制起始相關(guān)的序列,主要包括兩大類:一類是編碼蛋白的開放閱讀框架ORF,在乳酸桿菌中與質(zhì)粒復(fù)制相關(guān)的ORF之間存在同源性。另一類是與調(diào)控有關(guān)的非編碼序列,主要包括復(fù)制相關(guān)蛋白作用的靶序列、正-負(fù)向復(fù)制起始點(diǎn)、缺失位點(diǎn)、啟動子等復(fù)制調(diào)控元件;另一種是控制質(zhì)?？截悢?shù)和不相容性的DNA序列。為了開發(fā)適用于人和動物的食品級乳酸桿菌表達(dá)載體,研究者尋求構(gòu)建非抗生素標(biāo)記的質(zhì)粒載體,現(xiàn)在用于乳酸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的食品級選擇性標(biāo)記主要有三類:糖類利用標(biāo)記、營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記、編碼細(xì)菌素抗性,這樣構(gòu)建出的乳酸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中,載體、受體及誘導(dǎo)物均為食品級,可直接制成口服制劑。所以,食品級的乳酸桿菌工程菌可直接應(yīng)用于食品工業(yè)和醫(yī)藥保健等領(lǐng)域,有著巨大的應(yīng)用前景和潛在的商業(yè)價值。(1)質(zhì)粒載體的連接糖類作為選擇標(biāo)記,主要是利用某種糖僅為少數(shù)乳酸桿菌利用,而其他乳酸桿菌不能利用其為發(fā)酵底物,將能發(fā)酵這種物質(zhì)的乳酸桿菌的基因克隆與乳酸桿菌的質(zhì)粒載體連接,轉(zhuǎn)化不能利用這種物質(zhì)的乳酸桿菌中進(jìn)行表達(dá),這樣就可通過該物質(zhì)作為底物來篩選。POSNO等把可發(fā)酵木糖的戊糖乳酸桿菌MD353染色體上的xyl基因克隆到大腸埃希菌-乳酸桿菌穿梭載體pLP3537,得到重組pLP3537-xyl質(zhì)粒,再將其轉(zhuǎn)入不能利用木糖的干酪乳酸桿菌ATCC393中,結(jié)果轉(zhuǎn)化子獲得了可利用木糖的能力,由此得到利用木糖發(fā)酵作為乳酸桿菌食品級選擇標(biāo)記。(2)外源基因穩(wěn)定表達(dá)一類為以細(xì)菌管家基因缺陷株為受體菌,在質(zhì)粒上克隆入同源或異源完整的受體菌缺陷基因作為外源基因穩(wěn)定表達(dá)的選擇標(biāo)記。此外,還有氨基酸缺陷有關(guān)的選擇標(biāo)記。(3)cinf基因lafI基因是LactobacillusjohnsoniiVP111088產(chǎn)生的LactacinF的免疫基因,lafI標(biāo)記片段小、通用性好,可在許多對LactacinF敏感的乳酸桿菌中使用。此外,嗜酸乳酸桿菌的AciocinA和AciocinB的結(jié)構(gòu)基因和免疫基因已分別在干酪乳酸桿菌與植物乳酸桿菌和發(fā)酵乳酸桿菌中表達(dá),這都給利用細(xì)菌素免疫基因作為食品級標(biāo)記提供了可能。2.3乳酸桿菌的免疫活性因子乳酸桿菌是公認(rèn)安全級(GRAS)菌,其自身及其各種代謝產(chǎn)物對機(jī)體也有營養(yǎng)和免疫功能,再加上其攜帶的目的蛋白的專一性作用,集多種功能于一體,這就是目前在微生態(tài)學(xué)領(lǐng)域中提出的多功能微生態(tài)制劑,因此乳酸桿菌食品級載體的研究與開發(fā)具有相當(dāng)大的潛力和意義。乳酸桿菌是一種良好的疫苗載體,用乳酸桿菌作為疫苗載體不僅可使口服的乳酸桿菌刺激產(chǎn)生粘膜及全身免疫反應(yīng),提高某些免疫活性因子如IL-2、IFN-α的分泌,而且可將特異性抗原分子攜帶并分泌到腸道,同時也可穿過腸壁進(jìn)入粘膜下層,進(jìn)而引起細(xì)胞免疫和體液免疫。在“全球健康重大挑戰(zhàn)”計(jì)劃中,有一項(xiàng)“改進(jìn)兒童疫苗,在嬰兒出生后不久即可服用,發(fā)展不需要注射的疫苗接種系統(tǒng)”,這項(xiàng)計(jì)劃向我們展示了未來疫苗開發(fā)的重點(diǎn)可能是口服疫苗,因此乳酸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的研制成功可能會引起一場免疫學(xué)界的革命。目前,用破傷風(fēng)毒素C片段(TTFC)作模型抗原已獲得許多乳酸桿菌用于免疫接種的知識,并且結(jié)合人們對免疫系統(tǒng)認(rèn)識的不斷提高及近來克隆和表達(dá)技術(shù)的發(fā)展,將能利用TTFC以外的抗原,開辟了乳酸桿菌作為活疫苗的真實(shí)前景。更有意義的是,法國和巴西已于2000年聯(lián)手開展在乳酸桿菌中表達(dá)輪狀病毒的抗原基因,然后用重組的乳酸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)酸奶,來預(yù)防兒童輪狀病毒性腹瀉。用乳酸桿菌表達(dá)外源基因還存在著缺陷,如對乳酸桿菌表達(dá)調(diào)控的機(jī)制尚不太清楚,直接口服重組乳酸桿菌并不能在體內(nèi)表達(dá)足量的抗原,長期低劑量的刺激可能導(dǎo)致機(jī)體免疫耐受,口服重組乳酸桿菌可能只對局部病變有較好的預(yù)防效果等。但隨著研究水平的提高,通過對乳酸桿菌進(jìn)一步改造、表達(dá)調(diào)控的認(rèn)識不斷深入和對免疫學(xué)特別是粘膜免疫機(jī)制的研究,我們將會得到更為優(yōu)良的益生乳酸桿菌基因工程菌。3雙歧桿菌穿透載體雙歧桿菌作為基因工程受體菌,對其基因表達(dá)系統(tǒng)的研究相對較少。SGORBATI等對1461株共24個種的雙歧桿菌進(jìn)行了質(zhì)粒的檢測,發(fā)現(xiàn)四個種的雙歧桿菌即長雙歧桿菌、球雙歧桿菌、星狀雙歧桿菌及印度雙歧桿菌含有質(zhì)粒。國外學(xué)者正努力尋找適用雙歧桿菌基因工程載體,MISSICH等成功地構(gòu)建了l個