白假絲酵母菌生物膜形成過程中耐藥性的變化

白假絲酵母菌生物膜形成過程中耐藥性的變化

陰道假絲菌病（vvc）是陰道常見的炎癥。在vvc中，約80%和90%的核電站是白假絲菌（koda）?，F(xiàn)在，在難治性真菌感染的大部分病變中，發(fā)現(xiàn)了生物膜（bf）感染的源，這增加了對(duì)真菌藥物的抵抗力。本課題通過研究VVC白假絲酵母菌在游離狀態(tài)、4hBF及48hBF狀態(tài)下氟康唑(Fluconazole,FCZ)的最低抑菌濃度(minimalinhibitoryconcentration,MIC)值,明確生物膜在白假絲酵母菌感染中的作用,為臨床治療提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1法藥敏實(shí)驗(yàn)鑒定受試菌株20株為白假絲酵母菌,均來源于VVC患者的陰道分泌物,并經(jīng)形態(tài)學(xué)和紙片法藥敏實(shí)驗(yàn)鑒定均為氟康唑敏感菌株。1株近平滑假絲酵母菌(Candidaparapsilosis)ATCC22019及1株克柔假絲酵母菌(Candidakrusei)ATCC6258為質(zhì)控株。所有菌株均由北京大學(xué)第一醫(yī)院微生態(tài)實(shí)驗(yàn)室提供。1.1.2培養(yǎng)基和試劑酵母粉,蛋白胨,葡萄糖,氯化鈉(NaCl),氯化鉀(KCl),磷酸氫二鈉(Na2HPO4),磷酸二氫鉀(KH2PO4),沙保氏氯霉素瓊脂培養(yǎng)基、科瑪嘉顯色培養(yǎng)基(北京新隆福醫(yī)藥),氟康唑(中國(guó)藥品生物制品鑒定所),小牛血清(北京諾其雅生物),熒光染料FITC-ConA(Sigma公司)。1.1.3儀器和細(xì)胞培養(yǎng)板熒光顯微鏡(OlympusBX60),JSM5600-LV電鏡(JEOL日本電子),96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國(guó)Corning),1cm×1cm蓋玻片(北京諾其雅)。1.1.4熒光染料溶液的制備(1)YPD培養(yǎng)液的配制:將酵母粉10g,蛋白胨20g,葡萄糖20g溶解于1L蒸餾水中,分裝后高壓蒸氣滅菌15min,冷卻后置4℃冰箱備用。(2)抗真菌藥液的制備:將1280μg氟康唑粉末充分溶解于1ml滅菌用水里,制備成濃度為1280μg/ml原液,置于-20℃冰箱備用。同法制備濃度為2560μg/ml原液。保證抗真菌藥物原液濃度至少應(yīng)10倍于藥敏實(shí)驗(yàn)時(shí)的最高濃度。(3)熒光染料FITC-ConA的配制:將FITC-ConA粉末1mg加入用pH7.4PBS液1ml配制成濃度為1mg/ml原液,分裝后置于-20℃冰箱備用。使用前將其用PBS液稀釋為50μg/ml。1.2方法1.2.1pbs的制備(1)生物膜的制備:蓋玻片(1cm×1cm)滅菌后,用小牛血清4℃浸泡12h,然后用pH7.4滅菌的PBS沖洗3遍,將蓋玻片轉(zhuǎn)移到6孔板里,然后加入3ml濃度為(0.5～2.5)×106個(gè)菌細(xì)胞/ml菌懸液,37℃孵育90min,pH7.4無菌PBS沖洗3遍,除去沒有黏附的真菌細(xì)胞,將沖洗后的蓋玻片轉(zhuǎn)移到另一新的6孔板中,每孔加入3mlYPD培養(yǎng)液37℃培養(yǎng),分別在4、8、12、24、48h用pH7.4滅菌PBS沖洗3遍。(2)熒光染色及顯微鏡觀察:將上述不同時(shí)間段的BF蓋玻片,每張蓋玻片表面滴加FITC-conA(染色濃度50μg/ml)50μl,室溫下避光孵育1h,pH7.4無菌PBS清洗除去未結(jié)合的染料,置于熒光顯微鏡下觀察。(3)掃描電鏡樣品制備及觀察:將上述不同時(shí)間段的BF蓋玻片,PBS沖洗后立即用3%戊二醛固定2h,然后經(jīng)過1%鋨酸固定2h、乙醇梯度脫水、乙酸異戊酯浸透、臨界點(diǎn)干燥、離子濺射儀噴金鍍膜一系列步驟后,置于電鏡下觀察。1.2.2氟康唑克氏體/酯類耐藥藥物5(1)菌懸液制備:將受試菌接種在沙保瓊脂培養(yǎng)基上,置37℃,傳代培養(yǎng)。挑取生長(zhǎng)24h直徑約1mm白假絲酵母菌菌落3～5個(gè),懸浮于2ml8.5g/L無菌氯化鈉溶液中,調(diào)整其濁度達(dá)到0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn),相當(dāng)于每毫升含(1～5)×106個(gè)菌細(xì)胞。用YPD培養(yǎng)基1:50稀釋后,再1∶20稀釋,使其濃度為(1～5)×103菌細(xì)胞/ml。(2)96孔板制備:每排有12孔,除第1孔加入160μlYPD液體培養(yǎng)基外,其余每孔加入100μl,在第1孔加入氟康唑抗真菌藥物原液(1280μg/ml)40μl混勻,然后吸取100μl至第2孔,混勻后再吸取100μl至第3孔,如此連續(xù)倍比稀釋至第10孔,并從第10孔中吸取100μl棄去,第11孔為不含藥物的生長(zhǎng)對(duì)照孔,第12孔為空白對(duì)照孔。(3)NCCLS微量滴定法:將濃度為(1～5)×103CFU/ml菌懸液100μl從第1孔到第11孔依次加入事先準(zhǔn)備好的96孔板里,每個(gè)藥物質(zhì)量濃度均有3孔作為重復(fù)。(4)質(zhì)量控制:以近平滑假絲酵母菌ATCC22019和克柔假絲酵母菌ATCC6258為質(zhì)控株進(jìn)行質(zhì)量控制。(5)結(jié)果判讀:37℃培養(yǎng),分別在24h及48h觀察結(jié)果。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):完全透明0分,霧狀渾濁1分;濁度明顯降低2分;濁度輕度下降3分;濁度未降低4分。氟康唑由于具有抑菌拖尾現(xiàn)象,故以評(píng)分2作MIC,最終以48h的藥物濃度作為其對(duì)氟康唑的MIC。1.2.3白假絲酵母菌生物膜的制備(1)菌懸液制備:將受試菌接種在沙保瓊脂培養(yǎng)基上,置37℃,傳代培養(yǎng)。挑取生長(zhǎng)24h直徑約1mm的白假絲酵母菌菌落3～5個(gè),懸浮于2ml8.5g/L無菌氯化鈉溶液中,調(diào)整其濁度達(dá)到0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn),相當(dāng)于每毫升含(1～5)×106個(gè)菌細(xì)胞,用YPD培養(yǎng)基1∶1稀釋后,濃度為(0.5～2.5)×106個(gè)菌細(xì)胞/ml。(2)96孔板法形成白假絲酵母菌生物膜:取濃度為(0.5～2.5)×106CFU/ml100μl菌懸液從第1孔到第11孔依次接種于96孔培養(yǎng)皿中,37℃培養(yǎng)90min,為黏附階段,用pH7.4無菌PBS沖洗3遍,清除未黏附的真菌細(xì)胞,然后每孔加入YPD培養(yǎng)基100μl,37℃繼續(xù)培養(yǎng),分別在4h及48h形成不同階段的生物膜結(jié)構(gòu),再次棄去培養(yǎng)基及懸浮的白假絲酵母菌,PBS沖洗3遍。(3)生物膜藥敏實(shí)驗(yàn):將2倍藥物質(zhì)量濃度(2560μg/ml)以倍比稀釋方法(類似于浮游狀態(tài)下藥物稀釋方法,不同的是氟康唑最終質(zhì)量濃度分別為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml)加到各孔繼續(xù)37℃培養(yǎng)48h,與生長(zhǎng)對(duì)照孔相比,以濁度明顯減低孔的藥物質(zhì)量濃度為MIC,每個(gè)藥物質(zhì)量濃度均有3個(gè)孔做為重復(fù)。1.3統(tǒng)計(jì)處理應(yīng)用SPSS13.0版本軟件,各狀態(tài)下藥敏情況分析使用FriedmanM秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1細(xì)胞外多糖基質(zhì)的分離和復(fù)合微菌落的形成4hBF狀態(tài)下白假絲酵母菌散在分布,開始分泌少量細(xì)胞外多糖基質(zhì),為菌體黏附,定植階段,見圖1A;8hBF狀態(tài)下白假絲酵母菌已出現(xiàn)分散的微菌落,并逐漸融合,細(xì)胞外多糖基質(zhì)分泌較前增多,見圖1B;24hBF狀態(tài)下白假絲酵母菌微菌落逐漸增多,并相互融合成團(tuán)塊狀;同時(shí)分泌細(xì)胞外多糖基質(zhì)增多,逐步覆蓋在微菌落表面,見圖1C;48hBF狀態(tài)下白假絲酵母菌菌細(xì)胞不斷增多,塊狀菌落更加相互融合;分泌細(xì)胞外多糖基質(zhì)更加明顯,幾乎完全包裹菌細(xì)胞,生物膜初步形成,見圖1D。2.2hbf狀態(tài)下白假絲母菌生長(zhǎng)情況4hBF狀態(tài)下白假絲酵母菌菌細(xì)胞以芽生孢子(酵母相)黏附在材料表明,并且菌細(xì)胞之間互相黏附形成微菌落,見圖2A;12hBF狀態(tài)下白假絲酵母菌菌細(xì)胞數(shù)量逐漸增多,微菌落逐漸增大并相互融合,見圖2B;48hBF狀態(tài)下白假絲酵母菌菌細(xì)胞已經(jīng)芽生出菌絲體及假菌絲,菌細(xì)胞、菌絲體及假菌絲形成排列密集的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),見圖2C;72hBF狀態(tài)下白假絲酵母菌菌細(xì)胞、菌絲體及假菌絲越來越多,相互形成更加密集、結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu),見圖2D。2.3游離狀態(tài)、4hbf、48hbf的比較見表1、圖3。48h最小抑菌濃度MIC從小到大依次為:游離狀態(tài)、4hBF、48hBF,且兩兩之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3討論3.1白假絲酵母菌的耐藥生物膜是微生物為適應(yīng)生存環(huán)境而形成的,是其不可逆地與無活力物體或活組織表面接觸,由其自身產(chǎn)生多糖、蛋白或核酸等構(gòu)成的細(xì)胞外多聚基質(zhì)(extracellularmaxtrix,ECM)包裹自身菌落形成有結(jié)構(gòu)的菌細(xì)胞群體?？尚纬缮锬さ某Ｒ娢⑸镉?淋病奈瑟菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、表皮葡萄球菌、大腸桿菌、陰道加德納菌、假絲酵母菌等。生物膜中的微生物擁有其浮游狀態(tài)下根本不具備的生物學(xué)特性,幾乎所有的微生物在生物膜中對(duì)絕大多數(shù)抗生素有較強(qiáng)的耐藥性,在很多慢性感染中,微生物生活在生物膜中,從而成為宿主的一個(gè)持續(xù)性感染源。有資料顯示在所有假絲酵母菌性感染中,白假絲酵母菌感染率占45%。同時(shí)由于白假絲酵母菌的生物膜對(duì)抗真菌藥物具有較強(qiáng)耐藥性,所以由白假絲酵母菌引起的感染常常難以控制并且反復(fù)發(fā)作。本課題測(cè)定了白假絲酵母菌在游離狀態(tài)及生物膜狀態(tài)下對(duì)抗真菌藥物的MIC值,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著生物膜的逐漸成熟,其耐藥性明顯增強(qiáng),同時(shí)也可以說明普通的藥敏實(shí)驗(yàn)并不能確切的反應(yīng)白假絲酵母菌的藥敏情況。典型的白假絲酵母菌生物膜的形成分為三期:早期(1～11h),中期(12～30h),成熟期(31～72h)。Chandra等觀察了白假絲酵母菌生物膜的形成過程,早期白假絲酵母菌細(xì)胞主要以芽生孢子(酵母相)的形態(tài)出現(xiàn),隨后芽管開始形成,出現(xiàn)分散的微菌落,并逐漸融合。中期的早期階段(12～14h)主要是微菌落中的菌細(xì)胞不斷分泌細(xì)胞外基質(zhì)并且逐漸覆蓋其表面,直至完全包裹。成熟的白假絲酵母菌生物膜是由細(xì)胞外基質(zhì)包裹著細(xì)胞,厚度可達(dá)450μm,內(nèi)有大量菌絲樣細(xì)胞生長(zhǎng),形成一個(gè)在細(xì)胞外基質(zhì)包裹下的由孢子、菌絲體和假菌絲組成的致密的網(wǎng)狀系統(tǒng),呈一個(gè)有機(jī)的三維結(jié)構(gòu)。3.2熒光顯微鏡觀察和模型建立的研究Basma等對(duì)116株臨床分離的白假絲酵母菌進(jìn)行耐藥性研究,結(jié)果表明耐藥性由高到低依次為:伊曲康唑<伏立康唑<酮康唑<氟康唑。同時(shí)劉華等在260例假絲酵母菌耐藥性分析中發(fā)現(xiàn),其中的155例白假絲酵母菌對(duì)不同藥物的耐藥率依次為:5-氟胞嘧啶(5.8%)<氟康唑(9%)=兩性霉素B(9%)<制霉菌素(10.3%)<益康唑(40.9%)<酮康唑(43%)<咪康唑(43.7%)。相反吳達(dá)山在對(duì)102株陰道白假絲酵母菌藥敏分析過程中發(fā)現(xiàn)不同藥物的耐藥性依次為:氟胞嘧啶(4%)<兩性霉素(6%)<制霉素(11%)<酮康唑(27%)<伊曲康唑(48%)<咪康唑(51%)<氟康唑(70%)。基于上述的觀點(diǎn),為了排除真菌的耐藥性是真菌本身已經(jīng)存在的耐藥性還是生物膜的耐藥性以及更好的研究生物膜的藥物敏感性,本課題所采用的白假絲酵母菌經(jīng)過科瑪嘉顯色培養(yǎng)基分離培養(yǎng)、格蘭染色形態(tài)學(xué)觀察、紙片法藥敏分析鑒定均為氟康唑敏感菌株。Martinez等研究了不同固體表面支撐材料對(duì)真菌粘附及生物膜形成能力的差異,發(fā)現(xiàn)新型隱球菌菌株B3501形成生物膜的能力依次為:聚氯乙烯>玻璃>聚苯乙烯>聚碳酸酯;在生物膜形成早期階段(0～8h),新型隱球菌菌株B3501在玻璃、聚苯乙烯、聚碳酸酯表現(xiàn)出相似的代謝活性,但是在玻璃表面形成的生物膜更好,本實(shí)驗(yàn)選用玻璃材質(zhì)的蓋玻片建立生物膜模型,一方面是為了能夠建立更好的生物膜模型,另一方面也印證了前人的研究成果。實(shí)驗(yàn)中,雖然生物膜制備的過程相同,但由于熒光顯微鏡和掃描電鏡的標(biāo)本制備方式不同,用于電鏡觀察的蓋玻片上的生物膜其細(xì)胞數(shù)目明顯少于用于熒光顯微鏡觀察的蓋玻片上的生物膜,隨著蓋玻片沖洗次數(shù)的增多生物膜內(nèi)的細(xì)胞數(shù)目會(huì)隨之減少,相應(yīng)的生物膜結(jié)構(gòu)也必然遭到破壞。Strathmann等在熒光顯微鏡下觀察銅綠假單胞菌SG81生物膜結(jié)構(gòu)時(shí),采用的是外源性凝集素和FITC共價(jià)結(jié)合的一種染料,實(shí)驗(yàn)濃度為10μg/ml,室溫下避光孵育時(shí)間為30min。本實(shí)驗(yàn)中使用的熒光染料FITC-conA與上述的染料是同一性質(zhì),該染料是一種帶有熒光的凝集素,可與多種糖基尤其與生物膜的多糖成分相結(jié)合,實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)濃度為10μg/mlFITC-conA時(shí),延長(zhǎng)避光孵育時(shí)間至2h后,熒光顯微鏡下觀察仍舊幾乎是一片黑色,偶可以看見少量暗淡的黃綠色熒光,逐步增加染料濃度至50μg/ml時(shí),室溫孵育30min后,顯微鏡下可見明亮的黃綠色熒光散在分布,產(chǎn)生這種差別的因素考慮為:(1)可能是因?yàn)榉跤臏囟群臀墨I(xiàn)中所說的“室溫”可能有差別,(2)可能是因?yàn)椴煌⑸镄纬缮锬さ哪芰Σ煌?(3)可能是因?yàn)闊晒馊玖系姆N類不同。本課題利用FITC-ConA對(duì)白假絲酵母菌生物膜中菌細(xì)胞分泌的細(xì)胞外多糖進(jìn)行染色,通過熒光顯微鏡觀察不同時(shí)間階段的生物膜中多糖成分的變化。研究發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的延長(zhǎng),生物膜中的菌細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞外多糖基質(zhì)逐漸增多,48h已形成典型的生物膜結(jié)構(gòu),由此可見細(xì)胞外多糖成分在BF的耐藥性當(dāng)中起到重要作用。同時(shí)在掃描電鏡下也可以看到上述典型的生物膜的動(dòng)態(tài)形成過程。3.3耐藥機(jī)制的復(fù)雜性微生物生物膜耐藥機(jī)制目前尚不明確,人們發(fā)現(xiàn)其可能的耐藥基質(zhì)主要包括藥物流出泵基因活性增加、細(xì)胞膜表面甾醇代謝異常、生物膜的機(jī)械屏障作用、生物膜內(nèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)速率、對(duì)抗機(jī)體的免疫防御機(jī)制等,其中酵母樣真菌對(duì)唑類抗真菌藥物耐藥性的產(chǎn)生可能的原因有:(1)編碼14α-羊毛甾醇去甲基化酶的基因ERG11過度表達(dá),(2)Erg11蛋白空間結(jié)構(gòu)的改變使其對(duì)唑類抗真菌藥物的親和力降低,(3)由于編碼藥物流出泵基因MDR1、CDR1、CDR2的過度表達(dá),抗真菌藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)導(dǎo)致細(xì)胞膜表面質(zhì)子泵及ATP的耗竭,從而導(dǎo)致細(xì)胞的衰竭,(4)由ERG3基因編碼的甾醇C5、C6-脫氫酶失活,從而使麥角甾醇生物合成途徑受阻。另外,宿主本身的免疫防御機(jī)制在生物膜形成過程中也發(fā)揮了重要的作用。白假絲酵母菌生物膜具體的耐藥機(jī)制之一可能與甘露糖結(jié)合受體及單核巨噬細(xì)胞有關(guān),牛戰(zhàn)琴等發(fā)現(xiàn)小鼠陰道上皮細(xì)胞表面的甘露糖結(jié)合受體介導(dǎo)了與白色念珠菌之間的粘附,此受體蛋白上的糖鏈可能參與了陰道上皮細(xì)胞的抗白色念珠菌作用。鄭錄清等指出單核巨噬細(xì)胞在對(duì)抗小鼠陰道假絲酵母菌感染中起保護(hù)作用,特別是對(duì)2次感染的小鼠,且局部作用大于系統(tǒng)作用。綜上所述,生物膜是一種微生物為適應(yīng)環(huán)境而形成的一種特定的生長(zhǎng)方式,白假絲酵母菌生物膜的形成與其耐藥性密切相關(guān),由于生物膜的抵抗力主要取決于多細(xì)胞群體中的細(xì)菌聚集,應(yīng)當(dāng)將治療策略鎖定在破壞生物膜多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的形成。生物膜形成的影響因素和耐藥機(jī)制的復(fù)雜性決定了生物膜相關(guān)性感染的臨床治療極為困難。由于其確切的耐藥機(jī)制尚不明確,因而無法制定針對(duì)性的治療方案。目前尚未形成國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的治療指南,現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道均為個(gè)人經(jīng)驗(yàn)。例如:王欒玲等認(rèn)為,高濃度臭氧溶液治療女性復(fù)發(fā)性外陰