益氣酰胺湯對(duì)d-半乳糖鼠免疫功能的影響

益氣酰胺湯對(duì)d-半乳糖鼠免疫功能的影響

現(xiàn)代研究表明，免疫功能下降是衰老的主要原因之一。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為脾虛是衰老的重要原因。李東垣是“補(bǔ)土派”的代表人物,他提出了“內(nèi)傷脾胃,百病由生”的論點(diǎn),而益氣升陽法是其補(bǔ)土的主要法則,其益氣聰明湯是其代表方之一。筆者運(yùn)用該方在治療老年人腦動(dòng)脈硬化、老年癡呆、耳鳴耳聾等常見病、多發(fā)病以及在緩解疲勞、增強(qiáng)記憶力等方面均取得良好療效?；诖?本實(shí)驗(yàn)采用D-半乳糖皮下注射建立衰老動(dòng)物模型,從衰老發(fā)生的免疫學(xué)說角度探討益氣聰明湯延緩衰老的作用機(jī)理。1材料表面1.1動(dòng)物和主要試劑的外觀1.2實(shí)驗(yàn)藥物2方法2.1小鼠衰老模型參照文獻(xiàn)和造模預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,除正常對(duì)照組外,其余各組均無菌操作頸背部皮下注射5%D-半乳糖生理鹽水0.25ml/(10g·d),每天一次,連續(xù)42天,造成小鼠衰老模型。同時(shí)正常對(duì)照組無菌操作頸背部皮下注射0.9%的生理鹽水0.25ml/(10g·d)。2.3脾淋巴細(xì)胞增值活性測(cè)定2.3.1血清采集實(shí)驗(yàn)第42天,用10%水合氯醛(4ml/kg)腹腔麻醉后,分離出頸動(dòng)脈,剪斷取血,用臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘,吸取血清,做好標(biāo)記,-20℃保存待測(cè)。2.3.2胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,將小鼠稱重,各組經(jīng)取血后,脫頸處死,75%酒精浸泡消毒,于超凈工作臺(tái)中無菌取出脾臟、胸腺,電子稱稱重,以臟器濕重(mg)/體重(g),表示小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。2.3.3血清IL-2的檢測(cè)采用放免法。2.3.4MTT比色試驗(yàn)測(cè)定脾淋巴細(xì)胞增值活性2.3.5脾淋巴細(xì)胞懸液制備參照文獻(xiàn),將脾臟放入盛有10ml無菌Hanks液平皿的100目銅網(wǎng)上,用無菌注射器芯擠壓研磨,使單個(gè)細(xì)胞經(jīng)網(wǎng)進(jìn)入Hanks液中。移吸細(xì)胞懸液至刻度離心管中,800r/min,離心10min。經(jīng)Tris-NH4Cl除去紅細(xì)胞,Hanks液洗3遍,鏡下細(xì)胞記數(shù),用含3%小牛血清(FBS)的RPMI1640完全培養(yǎng)液配成8×106/ml細(xì)胞懸液。2.3.6脾淋巴細(xì)胞增值活性的測(cè)定T淋巴細(xì)胞增殖活性測(cè)定:參照文獻(xiàn),將不同組的脾細(xì)胞懸液各取100μl分別置入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)。每鼠各設(shè)6個(gè)重復(fù)孔,其中3孔作為自發(fā)增殖對(duì)照孔,加入含3%小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液100μl/孔;其余3孔作為刺激增殖孔加入ConA100μL/孔(終濃度為5μg/ml)。置37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后取出,每孔加入5mg/ml的MTT10μl,繼續(xù)放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)6h后取出,貼壁吸上清液棄之,加入二甲基亞砜(DMSO)100μL/孔,充分振蕩后,靜止10min,在酶標(biāo)儀上波長570nm處測(cè)定OD值。B淋巴細(xì)胞增殖活性測(cè)定:參照文獻(xiàn),將刀豆蛋白A(ConA)換成脂多糖(LPS)20μl/孔(終濃度為50mg/L),其余操作與T淋巴細(xì)胞增殖活性測(cè)定相同。2.3.7淋巴細(xì)胞增值活性的結(jié)果分析參照文獻(xiàn),為避免淋巴細(xì)胞自發(fā)增殖作用的干擾,本實(shí)驗(yàn)采用ConA、LPS刺激脾淋巴細(xì)胞凈增值為檢測(cè)指標(biāo),即脾淋巴細(xì)胞凈增值(用ΔOD表示)等于ConA、LPS刺激脾淋巴細(xì)胞增殖孔的OD均值與自發(fā)增殖對(duì)照孔的OD均值之差。3處理數(shù)據(jù)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,組間比較采用單因素方差分析。4結(jié)果3.1一般情況下3.2各組大鼠免疫器官指數(shù)的比較見表13.3組大鼠血清中、小劑量及預(yù)測(cè)結(jié)果如表2示:與正常組比較,大劑量組IL-2含量無明顯差異(P>0.05);模型組、VitE組、小、中劑量組顯著降低(P<0.01)。四個(gè)治療組與模型組比較均顯著升高(P<0.01)。四個(gè)治療組之間比較:VitE組與中、小劑量組之間無明顯差異性(P>0.05);大劑量組顯著高于小劑量組、VitE組(P<0.01),也明顯高于中劑量組(P<0.05)。3.4各組脾淋巴結(jié)更新活性的比較見表34對(duì)特殊大鼠血清il-2、t細(xì)胞和b細(xì)胞的作用脾虛衰老學(xué)說是祖國醫(yī)學(xué)眾多衰老學(xué)說中最重要的之一。益氣聰明湯用藥嚴(yán)謹(jǐn),黃芪、人參為君,益氣升陽;葛根、升麻為臣升舉脾胃清陽,君臣合用,益氣升陽舉陷。佐以白芍、蔓荊子養(yǎng)肝明目,蔓荊子兼清利頭目;黃柏瀉火堅(jiān)陰,又防葛根、升麻升發(fā)太過;使以炙甘草,益氣和中,調(diào)和諸藥,合用則中氣充足,清陽上升,濁陰得降,九竅通利,耳聰目明。臨床中,我們運(yùn)用益氣聰明湯治療老年人常見病、多發(fā)病往往取得良好療效。隨增齡,免疫器官老化,免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子發(fā)生改變,機(jī)體的免疫功能逐漸減弱,感染性疾病、癌癥等發(fā)病率、死亡率增高,免疫衰老與個(gè)體壽命之間的聯(lián)系得到了大量證據(jù)支持。胸腺是免疫系統(tǒng)的中樞器官,是T淋巴細(xì)胞分化成熟的場(chǎng)所,對(duì)維持細(xì)胞免疫和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)起重要的作用。脾臟作為外周免疫器官,隨增齡而逐漸減小,性質(zhì)發(fā)生改變,是衰老時(shí)免疫功能降低的原因之一。T、B淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的核心。T淋巴細(xì)胞主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫。T細(xì)胞殺傷作用及產(chǎn)生細(xì)胞因子的能力降低是導(dǎo)致衰老及多種疾病和腫瘤等的重要原因,隨增齡T細(xì)胞在體外增殖能力下降。T細(xì)胞功能也發(fā)生改變,老年人及動(dòng)物T淋巴細(xì)胞對(duì)有絲分裂(ConA、PHA等)抗原刺激的增殖能力降低。B淋巴細(xì)胞主要介導(dǎo)體液免疫,能分泌多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。老年時(shí)B細(xì)胞功能以及在同樣抗原強(qiáng)度刺激下所動(dòng)員的B細(xì)胞數(shù)明顯減少,僅及正常小鼠1/10-1/50。IL-2由激活的T細(xì)胞產(chǎn)生,主要有:刺激激活的T細(xì)胞增生和產(chǎn)生細(xì)胞因子;激活NK細(xì)胞、刺激其生長;刺激B細(xì)胞增值和(或)分化以及分泌抗體的作用。這些細(xì)胞因子在細(xì)胞衰老和預(yù)期壽命中起著關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)表明:與正常組比較,模型組脾臟、胸腺指數(shù);血清IL-2含量;脾淋巴細(xì)胞增值活性均顯著降低(P<0.01),提示D-半乳糖致亞急性衰老模型小鼠可導(dǎo)致免疫衰老,亦可反證衰老的免疫學(xué)說。同時(shí)益氣聰明湯三個(gè)治療組均能有效升高小鼠免疫器官指數(shù)、血清IL-2含量、脾淋巴細(xì)胞增值活性,且升高幅度與其劑量基本呈正相關(guān),益氣聰明湯大劑量組與正常組相比已經(jīng)沒有明顯差異(P>0.05),提示益氣聰明湯有良好的增強(qiáng)衰老模型小鼠免疫功能的作用。昆明種小鼠60只,體重18～22g,2月齡,雌雄分養(yǎng)(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。D-半乳糖、噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO),Amresco公司;碘[125I]白細(xì)胞介素-2放射免疫試劑盒(北京科美東雅);刀豆蛋白(ConA)、脂多糖(LPS),sigma公司;RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基(Hyclone公司);小牛血清(杭州四季青)。益氣聰明湯按《東垣試效方》原方,由黃芪16g、人參16g、炙甘草16g、升麻10g、葛根10g、蔓荊子5g、白芍3g、黃柏(炒黃)3g組成,湖南中醫(yī)藥大學(xué)一附院藥房提供藥材,按傳統(tǒng)方法煎煮過濾,并于恒溫水浴鍋中濃縮至:大劑量:每毫升含生藥1.35g;中劑量:每毫升含生藥0.675g;小劑量每毫升含生藥0.3375g;4℃冰箱保存?zhèn)溆?。維生素E膠丸(100mg/粒),廣州白云山制藥總廠(批準(zhǔn)文號(hào):國藥準(zhǔn)字H44021557)。60只小鼠隨機(jī)均分6組,雌雄各半,分為:(1)正常組;(2)D-半乳糖模型組;(3)益氣聰明湯大劑量組27g/(kg·d);(4)中劑量組13.5g/(kg·d);(5)小劑量組6.75g/(kg·d);(6)維生素E對(duì)照組50mg/(kg·d)。在造模的同時(shí),模型給藥組分別灌胃相應(yīng)濃度藥物0.2ml/(10g·d);正常對(duì)照組、D-半乳糖模型組灌胃0.2ml/(10g·d)的生理鹽水。第42天做各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。2.2組大鼠前拜物酶指標(biāo)比較除正常組和大劑量組之外,余組均有小鼠死亡,模型組死亡2只,小、中劑量組及VitE組各死亡1只。如表1所示:與正常組比,大劑量組無明顯差異(P>0.05);模型組、VitE組、小劑量組脾臟和胸腺指數(shù)、中劑量組胸腺指數(shù)均顯著降低(P<0.01);四個(gè)治療組與模型組比顯著升高(P<0.01)。四個(gè)治療組之間比較:大劑量組顯著高于小劑量組、VitE組(P<0.01),也明顯高于中劑量組(P<0.05)。