益氣酰胺湯對d-半乳糖衰老小鼠的抗自由基作用

益氣酰胺湯對d-半乳糖衰老小鼠的抗自由基作用

雖然衰退不能抵抗，但它可以延遲，發(fā)現(xiàn)缺陷，科學(xué)地提出抗衰老的對策，是科學(xué)的先進水平?，F(xiàn)代研究認為,自由基損傷是衰老的主要機制之一。中醫(yī)中藥在延緩衰老方面有著悠久的傳統(tǒng)和獨特的優(yōu)勢,歷代醫(yī)家提出了多種學(xué)說,脾虛衰老學(xué)說是其中最重要的一種?！把a土派”的代表人物李東垣提出“內(nèi)傷脾胃,百病由生”的論點。把“益氣升陽法”做為補土的主要法則,而益氣聰明湯是其代表方。臨床中我們運用該方在治療老年人頭痛眩暈、腦動脈硬化、老年癡呆、耳鳴耳聾、白內(nèi)障等常見病、多發(fā)病,并發(fā)現(xiàn)該方在緩解疲勞、增強記憶力等方面均取得良好療效。提示益氣聰明湯有良好的延緩衰老作用,但未見文獻報道益氣聰明湯延緩衰老的動物實驗研究及其作用機理探討,基于此,本實驗采用D-半乳糖皮下注射建立衰老動物模型,從衰老發(fā)生的自由基學(xué)說角度探討益氣聰明湯延緩衰老的作用機理。1材料表面1.1實驗動物及飼料健康昆明種小鼠60只,體重18-22g,2月齡,雌雄分養(yǎng),自由攝取飼料(實驗動物以及飼料均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供,許可證號:醫(yī)動字第20-002號)。D-半乳糖(Amresco公司);超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程有限公司)1.2學(xué)養(yǎng)成藥、藥材、小劑量、現(xiàn)藥的配制益氣聰明湯按《東垣試效方》原方,由黃芪16g、人參16g、炙甘草16g、升麻10g、葛根10g、蔓荊子5g、白芍3g、黃柏(炒黃)3g組成,湖南中醫(yī)藥大學(xué)一附院藥房提供藥材,按傳統(tǒng)方法煎煮過濾,并于恒溫水浴鍋中濃縮至∶大劑量:每毫升含生藥1.35g;中劑量:每毫升含生藥0.675g;小劑量每毫升含生藥0.3375g;4℃冰箱保存?zhèn)溆?。維生素E膠丸(100mg/粒),市購,廣州白云山制藥總廠(批準文號:國藥準字H44021557)。2方法2.1模型2:不同劑量組患者的群60只小白鼠按隨機分為6組,每組10只,雌雄各半,分別為∶正常組,D-半乳糖模型組,益氣聰明湯大劑量組27g/(kg·d)、中劑量組13.5g/(kg·d)、小劑量組6.75g/(kg·d),維生素E對照組VitE50mg/(kg·d)。在造模的同時,模型給藥組分別灌胃相應(yīng)濃度藥物0.2ml/(10g·d);正常對照組、D-半乳糖模型組灌胃0.2ml/(10g·d)的生理鹽水。第42天做各項指標檢測。2.2小鼠衰老模型參照文獻和造模預(yù)實驗結(jié)果,除正常對照組外,其余各組均無菌操作頸背部皮下注射5%D-半乳糖生理鹽水0.25ml/(10g·d),每天一次,連續(xù)42天,造成小鼠衰老模型。同時正常對照組無菌操作頸背部皮下注射0.9%的生理鹽水0.25ml/(10g·d)。2.3觀察指標和測試方法2.3.1血清采集實驗(1)實驗中小鼠一般情況的觀察觀察小鼠精神、活動、皮毛光澤及皮膚彈性、飲食飲水量、大小便;(2)血清采集實驗第42天,用10%水合氯醛(4ml/kg)腹腔麻醉后,分離出頸動脈,剪斷取血,用臺式離心機離心10分鐘,吸取血清,做好標記,-20℃保存待測;(3)血清SOD、MDA的檢測均按照試劑盒說明書進行操作。2.3.2檢測方法(1)SOD活性的檢測采用黃嘌呤氧化酶法;(2)MDA含量的檢測采用硫代巴比妥酸(TBA)法。2.4處理數(shù)據(jù)的方法用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理,實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析。3結(jié)果3.1對小鼠的性能正常組小鼠精神好、行動敏捷、毛發(fā)光澤、皮膚彈性好、大便為成形黃褐便,無腥臭。模型組小鼠精神萎靡、行動遲緩、毛色枯槁、皮膚彈性差、大便溏,有腥臭。余組小鼠上述表現(xiàn)較模型組有良性逆轉(zhuǎn)。益氣聰明湯大劑量組較正常組小鼠外形無變化,活動如常,攝食可,大便為深褐色軟便。除正常組和大劑量組之外,余組均有小鼠死亡,模型組死亡2只,小、中劑量組及VitE組各死亡1只。3.2對血清sod活性的影響如表1所示:與正常組比,模型組、VitE對照組、小、中劑量組血清SOD活性顯著降低(P<0.01);但大劑量組與正常組比無明顯差異(P>0.05)。小、中、大劑量組與模型組比顯著升高(P<0.01);VitE對照組與模型組比明顯升高(P<0.05)。四個治療組之間比較:VitE對照組與小劑量組之間無明顯差異性(P>0.05);中劑量組顯著高于VitE對照組(P<0.01),也明顯高于小劑量組(P<0.05);大劑量組顯著高于小劑量組、VitE對照組(P<0.01),也明顯高于中劑量組(P<0.05)。由此可見:益氣聰明湯三個治療組均能有效升高血清SOD的活性,且升高幅度與其劑量呈正相關(guān)。VitE對照組也能有效升高血清SOD的活性,但益氣聰明湯大、中劑量組要優(yōu)于VitE對照組。3.3對血清mda含量的影響如表2所示:與正常組比,模型組、VitE對照組、小、中劑量組MDA含量顯著升高(P<0.01);大劑量組與正常組比無明顯差異(P>0.05)。四個治療組與模型組比顯著降低(P<0.01);四個治療組之間比較:VitE對照組與小劑量組之間無明顯差異性(P>0.05);中劑量組顯著低于VitE對照組(P<0.01),也明顯低于小劑量組(P<0.05);大劑量組顯著低于小劑量組、VitE對照組(P<0.01),也明顯低于中劑量組(P<0.05)。因此益氣聰明湯三個治療組均能有效降低血清MDA含量,且降低幅度與其劑量呈正相關(guān)。VitE對照組也能有效降低血清MDA含量,但益氣聰明湯大、中劑量組要優(yōu)于VitE對照組。4有關(guān)抗氧化能力的測量東垣脾胃學(xué)說是中醫(yī)發(fā)展史上的一個里程碑,他認為“元氣之充足,皆由脾胃之氣無所傷,而后能滋養(yǎng)元氣。若胃氣之本弱,飲食自倍,則脾胃之氣既傷,而元氣亦不能充,而諸病所由生也”,把益氣升陽法作為補土的重要原則,益氣聰明湯是益氣升陽法代表之一,全方黃芪、人參為君,益氣升陽;用葛根、升麻為臣升舉脾胃清陽,君臣合用,益氣升陽舉陷。佐以白芍、蔓荊子養(yǎng)肝明目,蔓荊子兼清利頭目;黃柏瀉火堅陰,又防葛根、升麻升發(fā)太過;使以炙甘草,益氣和中,調(diào)和諸藥,合用則中氣充足,清陽上升,濁陰得降,九竅通利,耳聰目明。主治“飲食不節(jié)、勞役形體,脾胃不足,得內(nèi)障、耳鳴,或多年目昏暗、視物不能”,并云,“此藥能令目廣大,久服無內(nèi)外障、耳鳴、耳聾之患,又令精神過倍,元氣自益,身輕體健,耳目聰明”。臨床中,我們運用益氣聰明湯治療老年人常見病、多發(fā)病往往取得良好療效。衰老的機制學(xué)說眾多,美國科學(xué)家Harman1955年提出衰老的自由基學(xué)說雖只是其中之一,但因它與其他學(xué)說有著直接或間接的關(guān)系,得到眾多實驗的支持,被廣大學(xué)者所公認,所以成為諸多學(xué)說的中心。自由基是單獨存在的、具有不成對電子的分子、原子、離子和基團,其本身極不穩(wěn)定,具有高度的反應(yīng)活性,它在細胞代謝過程中連續(xù)不斷地產(chǎn)生,廣泛地參與機體的生理與病理過程。機體內(nèi)同時存在著自由基清除系統(tǒng),其可以最大限度地防御自由基的損傷,自由基清除系統(tǒng)包括酶促反應(yīng)和非酶促反應(yīng)兩部分。酶促反應(yīng)所需酶有超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)等。非酶促反應(yīng)的作用物質(zhì)主要為一些抗氧化劑,主要有維生素E等。在正常情況下,自由基的產(chǎn)生和消除處于平衡狀態(tài),而衰老時,自由基的產(chǎn)生增多,清除減少,過多的自由基在體內(nèi)蓄積,表現(xiàn)為SOD、GSH-PX含量下降,而丙二醛(MDA)和脂褐素(LF)的含量上升,過量的氧自由基破壞了細胞及其重要成分,引起膜功能減退,蛋白質(zhì)和酶變性,DNA分子鏈斷裂或交聯(lián)等損傷,是加速衰老的重要因素。因此,消除體內(nèi)多余的自由基,可延緩衰老的過程。長期以來,SOD被作為衰老與抗衰老研究的經(jīng)典指標。衰老時SOD的變化與機體壽限呈正相關(guān)關(guān)系,SOD活性低下,壽命變短,而SOD回升,有利于增加壽限。因此,提高衰老機體中SOD水平,對于抗衰延壽無疑有重要價值。MDA是脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物之一,MDA含量高低反映氧自由基水平和過氧化反應(yīng)的強度和速率,是了解自由基導(dǎo)致機體組織、細胞損傷程度的重要指標。MDA與蛋白質(zhì)、核酸及某些磷脂交聯(lián)形成Schiff堿,累積形成脂褐素(LF),LF形成后可占據(jù)細胞空間,使細胞結(jié)構(gòu)呈退行性改變,加速細胞老化過程。同時LF的聚集又反過來影響線粒體的功能,使活性氧的生成進一步增加,從而形成惡性循環(huán)。因而測定MDA的含量常?？煞从硻C體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的速率或強度,可以間接反應(yīng)細胞受損害的程度,是公認的衰老指標。因此,本實驗選用SOD、MDA作