鹽脅迫下植物離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究進(jìn)展

鹽脅迫下植物離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究進(jìn)展

鹽場對植物的傷害主要包括兩個(gè)方面：一是土壤中的高溶解濃度導(dǎo)致的水分損失；其次，植物吸收大量鈉，尤其是鈉，吸收過度的鈉離子有害作用。高濃度Na+可置換質(zhì)膜和細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)所結(jié)合的Ca2+,膜所結(jié)合的離子中Na+/Ca2+比增加,膜的通透性增大,同時(shí),植物體內(nèi)活性氧代謝系統(tǒng)的平衡受到影響,活性氧含量增加,而活性氧清除劑(SOD等)活性及含量降低,膜脂過氧化或膜脂脫脂作用被啟動(dòng),而導(dǎo)致膜的完整性被破壞,差別透性喪失,電解質(zhì)及某些小分子有機(jī)物大量滲漏,細(xì)胞物質(zhì)交換平衡破壞,進(jìn)而導(dǎo)致一系列生理生化代謝紊亂,使植物受到傷害。植物降低Na+的毒害的主要策略有離子外排和區(qū)域化,這兩方面都與植物跨膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有著密切的關(guān)系。1鹽害過程中k+/na+吸收特性鉀是植物正常生長所必需的大量元素之一,參與植物許多生理生化過程包括酶活性調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)合成及滲透調(diào)節(jié)等,對植物生長起著非常重要的作用。因此保持胞質(zhì)內(nèi)較高的K+/Na+比對于植物生長非常必要。但在植物受到鹽害時(shí),這種高的K+/Na+比值往往由于Na+含量的增加而降低,這主要是因?yàn)镵+和Na+具有相似的水合離子半徑,使得部分運(yùn)輸K+的載體亦有運(yùn)輸Na+的功能。一般認(rèn)為植物對K+的吸收主要有兩種系統(tǒng):系統(tǒng)1為低親和性K+吸收系統(tǒng),在外界K+濃度較高(1~10mmol/L)時(shí)介導(dǎo)K+的吸收,是一種被動(dòng)的K+吸收過程,需要消耗能量,主要靠K+通道來完成;系統(tǒng)2為高親和性K+吸收系統(tǒng),在外界K+濃度較低(0.001~0.2mmol/L)時(shí)介導(dǎo)K+的吸收,主要由K+載體完成。1.1質(zhì)膜選擇性通道已確定的K+通道大致可分為3種類型:內(nèi)向整流K+通道(K+inwardrectifyingchannels,KIRCs)、外向整流K+通道(K+outwardrectifyingchannels,KORCs)、電壓不依賴型陽離子通道(voltageindependentcationchannels,VICs)。內(nèi)向整流K+通道(KIRCs)是對K+濃度敏感的、依賴電壓的、對K+親和力低的通道,如擬南芥的AKT1,主要存在于細(xì)胞的質(zhì)膜上,具有特殊的電勢依賴性,在細(xì)胞膜超極化(hyperpolarization)的電壓條件下被激活打開,即在跨膜電勢很低時(shí)被打開,引起胞外的K+流入胞內(nèi)。而擬南芥AKT1缺失突變體與野生型對鹽分所表現(xiàn)出的相似敏感性表明:AKT1沒有或極少有運(yùn)輸Na+的功能。外向整流K+通道(KORCs)在質(zhì)膜去極化時(shí)開放,介導(dǎo)K+外排及Na+內(nèi)流。通過膜片鉗技術(shù)已從許多植物品種和組織中鑒定到KORCs。從大麥根中分離出的KORCs具有較高的K+/Na+選擇性,而從擬南芥根細(xì)胞中得到KORCs卻對Na+有較高的選擇性。這些通道中有一種無選擇性外向整流通道(nonselectiveoutwardrectifyingconductance,NORC)對陽離子吸收沒有特殊選擇性,胞質(zhì)內(nèi)Ca2+離子濃度上升即可將其激活。許多研究表明,植物細(xì)胞質(zhì)膜上還存在電壓不依賴型陽離子通道(voltageindependentcationchannels,VIC),這些通道比電壓依賴型通道(KIRC和KORC)具有較高的Na+/K+選擇性。1998年Amtmann和Sanders提出了不同陽離子通道的簡單模型并認(rèn)為電壓不依賴型通道是高鹽環(huán)境中Na+吸收的主要途徑。1.2土壤生化活性基因目前從植物根中分離的高親和性K+運(yùn)輸載體有兩種,其一為與細(xì)菌(Achromobacter)和酵母(Saccharomycescerevisiae)同源的KUP-HAK基因家族(K+uptaketransporter-highaffinityK+transporter);其二為HKT1(highaffinityK+transporter)運(yùn)輸體,即高親和性K+運(yùn)輸體HKT。在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)6個(gè)編碼KUP-HAK高親和K+運(yùn)輸載體的同源基因,大麥中也發(fā)現(xiàn)AvHAK1和AvHAK2基因。HAK運(yùn)輸體通過K+/H+協(xié)同作用發(fā)揮效應(yīng)并有較高的K+選擇性,Na+可在毫摩爾濃度范圍內(nèi)競爭性阻礙HAK運(yùn)輸K+,且大麥AvHAK1在毫摩爾Na+濃度下可介導(dǎo)Na+吸收。小麥TaHKT1是第一個(gè)從植物中鑒定的編碼HKT1蛋白,在微摩爾Na+濃度下為Na+/K+協(xié)同運(yùn)輸體,在毫摩爾Na+濃度下為Na+單向運(yùn)輸體。而擬南芥AtHKT1只運(yùn)輸Na+,水稻HKT有2個(gè)基因編碼,OsHKT1類似AtHKT1為Na+運(yùn)輸體,而OsHKT2類似TaHKT1可作為Na+/K+協(xié)同運(yùn)輸體或單向運(yùn)輸體,OsHKT1基因轉(zhuǎn)錄活性在低外界K+濃度下增加而在高外界Na+濃度下降低。Rus等的研究結(jié)果進(jìn)一步表明HKT1蛋白在Na+吸收中的重要作用。鹽脅迫條件下,擬南芥hkt1-sos3雙突變體植株Na+含量明顯降低,甚至比野生型還低,而K+含量明顯高于野生型。由此可見AtHKT1不只是K+運(yùn)輸系統(tǒng),它也控制Na+內(nèi)流,是Na+和K+內(nèi)流系統(tǒng)調(diào)節(jié)者(regulator),同時(shí)也可能控制Na+進(jìn)入木質(zhì)部進(jìn)而控制Na+向地上部分的運(yùn)輸。以上結(jié)果可以看出,部分吸收和運(yùn)輸K+的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白確實(shí)有吸收和運(yùn)輸Na+的功能,但其具體的吸收機(jī)制和調(diào)控機(jī)制仍不清楚。2植物葉片聚合酶Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Na+/H+antiporterorexchanger,NHAorNHE)是酵母、藻類、動(dòng)物以及高等植物膜系統(tǒng)上普遍存在的一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,是一種依賴跨膜的Na+、H+濃度梯度而產(chǎn)生的電中性的Na+/H+1∶1跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。高等植物質(zhì)膜和液泡膜上的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)活性分別以質(zhì)膜上的P型H+-ATPase和液泡膜上的V型H+-ATPase、H+-PPiase建立的跨膜質(zhì)子梯度作為驅(qū)動(dòng)力,驅(qū)動(dòng)Na+運(yùn)出細(xì)胞或運(yùn)進(jìn)液泡。2.1鹽脅迫對北濱驗(yàn)植株agnhx1基因表達(dá)的影響目前研究較多的是液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,主要有擬南芥的AtNHX1、水稻的OsNHX1、小麥的TaNHX1、柑橘的cNHX1、番杏TtNHX1、玉米ZmNHX、堿蓬的SsNHX1(AF370358)、北濱藜的AgNHX1以及鹽角草的SeNHX(AY131235)等。它們都有高度保守的氨氯吡嗪咪結(jié)合位點(diǎn)(即·FF··LLPPI)。Na+對液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的誘導(dǎo)作用因部位不同而有差別。在NaCl脅迫下,擬南芥的AtNHX1mRNA水平在葉中是對照的4倍,而在根中幾乎與對照無差異。鹽脅迫能促進(jìn)北濱藜的根和葉中AgNHX1mRNA的轉(zhuǎn)錄及蛋白產(chǎn)物的增加。水稻幼苗用100mmol/LNaCl處理24h后,地上部的OsNHX1基因的轉(zhuǎn)錄水平比根中高,且地上部和根中分別是對照的2.3和1.8倍,證明OsNHX1經(jīng)鹽誘導(dǎo)后的表達(dá)增強(qiáng)且具有器官特異性。但無論在正常生長條件下還是在鹽分脅迫下,液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性和表達(dá)的調(diào)控機(jī)制還不十分清楚。對于植物液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的遺傳轉(zhuǎn)化研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)單一的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因能夠明顯提高作物的耐鹽性。Apse等對轉(zhuǎn)AtNHX1基因的擬南芥植株進(jìn)行了分析,過量表達(dá)Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在200mmol/LNaCl中能正常生長發(fā)育;免疫印跡表明,從轉(zhuǎn)化植株葉片中提純的液泡比從野生型中具有更多的AtNHX1的基因表達(dá)產(chǎn)物,液泡膜上Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活力增強(qiáng)。將北濱藜的AgNHX1轉(zhuǎn)入水稻中發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)化植株的耐鹽性是對照植株的8倍,且可以在300mmol/L的NaCl脅迫下存活3d。Zhang等將擬南芥的AtNHX1基因轉(zhuǎn)入番茄中,發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)基因番茄在200mmol/LNaCl脅迫下能夠正常生長、開花和結(jié)實(shí),且葉片中Na+濃度較高,而番茄果實(shí)中Na+濃度卻很低。2.2鹽脅迫因子正調(diào)控sos1基因表達(dá)相對于植物液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來說,質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SOS1,saltoverlysensitive)的研究較少。2002年美國亞利桑那大學(xué)植物科學(xué)系Zhu等以擬南芥為研究材料,通過快中子轟擊(fastneutronbombardment)、T-DNA誘變或化學(xué)突變(如EMS誘導(dǎo))等分析手段,篩選鹽敏感SOS突變體(saltoverlysensitive),從而鑒定了5個(gè)耐鹽相關(guān)基因,即:SOS1、SOS2、SOS3、SOS4和SOS5。SOS1基因編碼一個(gè)含有1146個(gè)氨基酸殘基、分子量為127kD的多肽(SOS1)。它的N端具有高度疏水性,并含有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域;親水性的C端較長(約700個(gè)氨基酸殘基),殘留在細(xì)胞質(zhì)中,SOS1蛋白N端的12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域與動(dòng)物或微生物的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(antiporter)結(jié)構(gòu)域相當(dāng)相似。Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)同源蛋白的進(jìn)化樹分析表明,擬南芥SOS1與其它植物、細(xì)菌和真菌質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,如裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)的SOD2、啤酒酵母(Schizosaccharomycescerevisiae)的NHA1以及假單胞桿菌(Pseudomonaasaeruginosa)的NhaP等的親源關(guān)系較近,而與動(dòng)物質(zhì)膜和植物液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白關(guān)系較遠(yuǎn),如NHE6、AtNHX1等。因此,SOS1很可能就是擬南芥質(zhì)膜上的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,在功能上起到把Na+排出細(xì)胞外的作用。Northern分析檢測SOS1基因在鹽脅迫下的表達(dá)情況:在沒有鹽脅迫因子存在的情況下,檢測到SOS1mRNA;鹽脅迫因子正調(diào)控SOS1mRNA,這個(gè)調(diào)控是針對NaCl的,它不發(fā)生在脫落酸或冷害處理的條件下,SOS1mRNA在擬南芥的根部的含量比在枝葉中多,在根部和地上部SOS1的表達(dá)都是由NaCl脅迫因子正調(diào)節(jié)的,這個(gè)正調(diào)控是與SOS1耐Na+離子的作用相一致的。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的有無和高低與植物的耐鹽性密切相關(guān),在高鹽濃度下植物可以分別通過質(zhì)膜和液泡膜上的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)將Na+運(yùn)出細(xì)胞和將Na+區(qū)域化在液泡內(nèi),維持細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Na+穩(wěn)態(tài)和K+/Na+比相對穩(wěn)定,以適應(yīng)鹽漬環(huán)境。3鹽脅迫對植物鹽質(zhì)和功能的影響鹽脅迫使植物質(zhì)膜受到破壞,大量Na+涌入細(xì)胞,從而也破壞了植物體內(nèi)原有的電勢平衡。植物質(zhì)膜H+-ATPase、液泡膜H+-ATPase和H+-PPase均具有維持細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的pH值的穩(wěn)定、為細(xì)胞吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)營養(yǎng)物質(zhì)及離子提供質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力(PMF:protonmotiveforce)等生理功能,Na+的外排和區(qū)隔化也都依賴跨膜電化學(xué)勢梯度提供能量。最近對擬南芥質(zhì)膜H+-ATPase的研究結(jié)果表明,質(zhì)膜H+-ATPase可能決定植物的耐鹽性。擬南芥編碼質(zhì)膜H+-ATPase的AHA4基因主要在根內(nèi)皮層和花中表達(dá),AHA4的缺失突變體(aha421)植株在NaCl脅迫下,根及地上部的Na+/K+比對照增加4~5倍,表明AHA4可調(diào)控Na+跨內(nèi)皮層流動(dòng)。鹽脅迫能夠激活植物液泡膜H+-ATPase活性和質(zhì)子泵的H+轉(zhuǎn)運(yùn)能力,主要包括蛋白豐度的提高、動(dòng)力學(xué)特征的改變、亞基成分的變化及表達(dá)調(diào)控的改變等。對鹽生植物堿蓬液泡膜H+-ATPase的研究表明,NaCl脅迫明顯增加了堿蓬液泡膜H+-ATPase的水解活性和酶活性,促進(jìn)了其A、B、H、c亞基的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)產(chǎn)物的增加。植物液泡膜H+-PPase主要負(fù)責(zé)H+向液泡內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)、控制胞質(zhì)pH值穩(wěn)定及焦磷酸代謝。過量表達(dá)擬南芥液泡膜H+-PPase轉(zhuǎn)基因植株的Na+/H+逆