鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病大鼠認(rèn)知功能損傷及海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的研究

鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病大鼠認(rèn)知功能損傷及海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的研究

糖尿病病房的發(fā)病機(jī)制糖尿病是一種全身代謝障礙的綜合性疾病。長期代謝障礙將導(dǎo)致眼、腎、心臟和神經(jīng)系統(tǒng)損傷。其中,糖尿病腦病是一種常見的與中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變和功能損傷相關(guān)的糖尿病并發(fā)癥。在1922年便有報(bào)道糖尿病能夠引起認(rèn)知功能損傷,隨后的大量研究表明這種認(rèn)知的損傷在Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病中都有發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn),糖尿病腦病患者出現(xiàn)嚴(yán)重的認(rèn)知功能障礙和不同程度生活自理困難,并且由糖尿病引發(fā)的癡呆比其他原因引起的癡呆發(fā)病率更高。臨床癥狀主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)、記憶、解決問題和運(yùn)動反應(yīng)速度能力等障礙。目前認(rèn)為糖尿病腦病的發(fā)病機(jī)制可能是糖尿病患者長期的高血糖引起脂質(zhì)代謝紊亂,血液黏稠度不斷升高,血管壁狹窄,最終造成腦部血供應(yīng)不足,從而誘發(fā)與認(rèn)知有關(guān)的腦神經(jīng)元細(xì)胞損傷。研究發(fā)現(xiàn),隨著發(fā)病時間的延長,與認(rèn)知相關(guān)的海馬CA1和CA2區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生凋亡,進(jìn)而表現(xiàn)出認(rèn)知下降。糖尿病腦病的發(fā)病機(jī)制已受到越來越多的人關(guān)注,但由于患者腦標(biāo)本難以獲得,因此把實(shí)驗(yàn)動物作為研究糖尿病腦病發(fā)病機(jī)制和藥物治療機(jī)制的模型已成為當(dāng)前研究的主要手段,科學(xué)實(shí)驗(yàn)和臨床研究迫切需求成熟的糖尿病腦病動物模型。由于糖尿病腦病主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)和記憶等功能障礙,形態(tài)學(xué)檢查也發(fā)現(xiàn)患者海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡或丟失,因此本研究從學(xué)習(xí)記憶能力以及與認(rèn)知相關(guān)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)變化的角度對鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)誘導(dǎo)的糖尿病腦病大鼠進(jìn)行研究。首先通過腹腔注射STZ構(gòu)建糖尿病大鼠模型,進(jìn)一步檢測和觀察糖尿病大鼠發(fā)病后不同病程時間的血糖、體重、行為學(xué)和海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn),對糖尿病腦病的發(fā)病情況進(jìn)行探討,為糖尿病腦病的進(jìn)一步藥物試驗(yàn)提供指導(dǎo)依據(jù)。1材料和方法1.1試劑和試劑STZ購自Sigma公司,蘇木精和伊紅購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,多聚甲醛購自北京化學(xué)試劑公司,其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑?？焖傺菣z測血糖儀購自上海新立生物技術(shù)公司,熒光倒置顯微鏡購自日本OLYMPUS公司,旋轉(zhuǎn)式薄片切片機(jī)購自德國萊卡公司,Y迷宮購自中科院上海生理所。1.2糖尿病大鼠造模實(shí)驗(yàn)和分組Wistar大鼠購自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,2月齡,體重230~250g,雄性,適應(yīng)一周之后,經(jīng)Y迷宮篩選除去認(rèn)知過于敏感或遲鈍的大鼠。糖尿病造模:一次性腹腔注射STZ(60mg/kg),給藥后分別在第3天和第7天2次檢測血糖,空腹血糖≥11.1mmol/L為造模成功,未成模者除去,給藥后第8天記作糖尿病發(fā)病第1天,最終取90只成功造模大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。以90只造模成功的大鼠作為糖尿病組進(jìn)行實(shí)驗(yàn),共分為9組,每組10只,分別在第20、30、40、50、60、70、80、90、100天進(jìn)行檢查。另取10只正常大鼠注射相應(yīng)劑量生理鹽水作為對照組。各組大鼠分籠飼養(yǎng),溫度為(24±1)℃,自由進(jìn)食進(jìn)水,12h光照。所有動物進(jìn)行血糖、體重、Y迷宮測試,然后處死、取腦、固定、染色、細(xì)胞計(jì)數(shù)觀察。1.3下一次正確率2.鼠具有喜暗避明習(xí)性,Y迷宮的工作原理就是通過對鼠明暗辨別特性學(xué)習(xí)記憶能力考查來評價(jià)其認(rèn)知能力。Y迷宮的實(shí)驗(yàn)操作條件為:40V直流電電壓,0.7mA電流。具體步驟為:首先將大鼠放入其中一個臂箱,適應(yīng)2min,隨機(jī)開啟另外兩個臂箱中的一個信號燈,短時間后如果大鼠一直停留在暗處或者跑到另外一黑暗處,就會遭到足底電擊,最終跑到亮燈的安全區(qū)域一次學(xué)習(xí)完成。間隔2min,進(jìn)行下一次訓(xùn)練。檢測要求為:大鼠由所在區(qū)域直接跑向安全區(qū)即為學(xué)習(xí)正確。每日訓(xùn)練20次,直到正確率連續(xù)達(dá)80%為學(xué)會。記錄訓(xùn)練次數(shù)、訓(xùn)練天數(shù)、錯誤的次數(shù)和反應(yīng)時間(到達(dá)安全區(qū)的時間,單位為s)。1.4苗木精-伊紅染色大鼠進(jìn)行乙醚深度麻醉,安樂處死,在冰臺上快速取出全腦,冰冷生理鹽水中洗凈組織表面血液,4%多聚甲醛固定48h(4℃保存),隨后用石蠟進(jìn)行包埋,切片(厚度6μm),進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色。具體操作步驟:固定,脫水,蘇木精染色5min,分化,沖洗,再伊紅染色,酒精梯度脫水,透明,封片,400倍鏡下觀察。海馬神經(jīng)元細(xì)胞計(jì)數(shù)方法:以海馬組織齒狀回上下側(cè)分支末端連線延長與海馬CA1區(qū)交界為中點(diǎn),沿海馬神經(jīng)元走向以交界中點(diǎn)為中心,向兩方向各延長0.5mm,取海馬CA1區(qū)細(xì)胞1mm長度作為實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)范圍,進(jìn)行計(jì)數(shù)并照相。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ue0af±s)表示,用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,組間均數(shù)采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較,當(dāng)P<0.05,認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1發(fā)病20d以上的糖尿病大鼠的體重變化檢測各組大鼠的血糖值和體重,結(jié)果如表1所示。與對照組相比,發(fā)病20d以上的糖尿病大鼠的體重明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。糖尿病大鼠由發(fā)病到處死一直處于高血糖狀態(tài),與空白對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.2認(rèn)知能力變化如表2所示,行為觀察結(jié)果表明,糖尿病鼠在發(fā)病40d內(nèi),認(rèn)知能力無明顯下降;發(fā)病50d能夠觀察到有輕微的認(rèn)知變化,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;發(fā)病60d以上開始表現(xiàn)出認(rèn)知損傷,訓(xùn)練次數(shù)、訓(xùn)練天數(shù)、錯誤次數(shù)和反應(yīng)時間與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.3糖尿病發(fā)病后ca1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)的變化HE染色結(jié)果如圖1所示。正常大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞規(guī)則排列,細(xì)胞圓而邊緣清晰,胞核、核仁、胞質(zhì)清晰可見;糖尿病發(fā)病40d,未表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)元細(xì)胞損傷;糖尿病發(fā)病50d以后,神經(jīng)元開始出現(xiàn)疏松,形態(tài)發(fā)生改變,排列松散,表現(xiàn)為細(xì)胞核固縮、胞質(zhì)減少等凋亡細(xì)胞特有表現(xiàn),或者是已經(jīng)壞死消失;當(dāng)發(fā)病60d后,其CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生大面積形態(tài)改變;發(fā)病70~100d的檢測結(jié)果顯示,細(xì)胞損傷越來越嚴(yán)重。2.4小鼠海馬ca1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量的變化如圖2所示,對照組的海馬CA1區(qū)每毫米存活神經(jīng)元細(xì)胞為(298±21)個;糖尿病發(fā)病50d海馬CA1區(qū)存活的神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;發(fā)病60d以上時,凋亡或壞死的神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增多,并且隨著發(fā)病時間的延長,細(xì)胞損傷越來越嚴(yán)重。3長期血糖狀態(tài)下大鼠認(rèn)知能力的變化本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)STZ誘導(dǎo)的大鼠,表現(xiàn)為多飲、多食、體重逐漸減輕、排尿量增多,符合典型的糖尿病發(fā)病特征,因此本實(shí)驗(yàn)糖尿病模型造模成功。很多研究報(bào)道已經(jīng)闡述了糖尿病并發(fā)癥中出現(xiàn)的細(xì)胞凋亡與長期的高血糖和氧化損傷有關(guān),長期的高血糖能夠引起實(shí)驗(yàn)動物的認(rèn)知能力下降。已有很多學(xué)者利用不同的檢測方法(包括Y迷宮、水迷宮等)對不同的糖尿病模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。Y迷宮作為一種辨別動物學(xué)習(xí)能力、工作記憶及參考記憶的檢測手段,具有簡便、可行等優(yōu)點(diǎn),并且具有一定的實(shí)用性。Y迷宮利用了嚙齒類動物對新異環(huán)境天然探究的自然習(xí)性,不需要動物學(xué)習(xí)任何規(guī)則來趨利避害,能夠有效地反映動物對新異環(huán)境的識別記憶能力。因此,本實(shí)驗(yàn)采用此方法檢測大鼠學(xué)習(xí)認(rèn)知能力。結(jié)果表明,STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠長期處于高血糖狀態(tài)(血糖值>23mmol/L),隨著發(fā)病時間的延長,Y迷宮的檢測結(jié)果顯示其認(rèn)知能力下降、反應(yīng)時間延長。有研究表明STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠在發(fā)病13周(91d左右)可出現(xiàn)晶狀體渾濁的白內(nèi)障表現(xiàn),發(fā)病24周可出現(xiàn)嚴(yán)重晶狀體渾濁。但是,本實(shí)驗(yàn)中僅少數(shù)幾只大鼠出現(xiàn)眼病,實(shí)驗(yàn)中已被排除。而且,Y迷宮實(shí)驗(yàn)在暗室中進(jìn)行,每個臂端裝有25度小燈泡,因此每臂的光強(qiáng)度足夠,即使大鼠出現(xiàn)輕微白內(nèi)障也能感受光的存在,因此可以排除該因素對Y迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的退行性神經(jīng)紊亂,可嚴(yán)重影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能,已在不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭斜缓芏鄬W(xué)者所闡述。大量的研究表明,海馬組織作為大腦的重要組成部分,與學(xué)習(xí)、記憶功能密切相關(guān),有學(xué)者認(rèn)為海馬可能就是大腦的主存儲器,尤其是海馬的CA1區(qū)神經(jīng)元與學(xué)習(xí)記憶功能的關(guān)系更為密切。長期的糖尿病引起海馬組織神經(jīng)元損傷,繼而引起細(xì)胞凋亡,最終導(dǎo)致學(xué)習(xí)、記憶功能下降。因此,本實(shí)驗(yàn)把檢測實(shí)驗(yàn)大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡或丟失作為重要的指標(biāo)。研究結(jié)果表明,長期高血糖狀態(tài)的大鼠,海馬CA1區(qū)神經(jīng)元發(fā)生細(xì)胞凋亡或丟失,并且隨著發(fā)