人基因重組骨形成蛋白-2對牙周韌帶細(xì)胞群成纖維表型的影響

人基因重組骨形成蛋白-2對牙周韌帶細(xì)胞群成纖維表型的影響

牙周韌帶細(xì)胞（pdlc）是具有不同質(zhì)的細(xì)胞，可以分為成骨和成纖維表面。這是將pdlc作為種子細(xì)胞建立起來的工程化和牙周膜的理論基礎(chǔ)。大量文獻(xiàn)證明人基因重組骨形成蛋白(recombinantbonemorphogeneticprotein,rhBMP-2)可以提高PDLC的堿性磷酸酶(ALP)活性,使其成骨表型增強(qiáng),可望利用rhBMP-2促進(jìn)種植牙牙周韌帶結(jié)構(gòu)形成。但是在rhBMP-2的作用下,PDLC的成纖維表型如何變化,rhBMP-2是否會(huì)使PDLC的成纖維表型完全喪失而導(dǎo)致種植牙牙周韌帶結(jié)構(gòu)失敗?本實(shí)驗(yàn)擬探討rhBMP-2對PDLC成纖維表型的影響。1材料和方法1.1多克隆抗體ndp-2高糖最低必須培養(yǎng)基(Gibco,美國),胰蛋白酶(sigma,美國),胎牛血清(Gibco,美國),rhBMP-2(第四軍醫(yī)大學(xué)生化教研室),表皮生長因子受體鼠抗人單克隆抗體,SP試劑盒,DAB試劑盒(北京中杉生物技術(shù)公司),超凈工作臺(tái)(蘇州凈安泰空氣技術(shù)有限公司),二氧化碳孵箱(Heraeus,德國),倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)(Nicon,日本)。1.2實(shí)驗(yàn)組1)對照組:PDLC用含20mL/L血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)。2)實(shí)驗(yàn)組:PDLC用含20mL/L血清和濃度分別為400μg/L,200μg/L,100μg/L,50μg/L,25μg/LrhBMP-2的培養(yǎng)液培養(yǎng)。1.3分離細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的制備取因正畸需要拔除的健康前磨牙,用刀片刮取根中1/3牙周膜組織,剪成1mm×1mm×1mm小塊,均勻鋪于培養(yǎng)瓶底,用含20mL/L血清培養(yǎng)液在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下培養(yǎng),待細(xì)胞長至80%匯合點(diǎn)時(shí),用2.5g/L胰蛋白酶消化傳代,波形蛋白染色陽性,角蛋白染色陰性證明其來源于外胚間充質(zhì),可用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。1.4細(xì)胞正常形態(tài)觀察取第3代細(xì)胞,按1×104個(gè)/mL接種于鋪有蓋玻片的培養(yǎng)瓶中,48h后待細(xì)胞貼壁并伸展至正常形態(tài)后,按實(shí)驗(yàn)分組加入培養(yǎng)液,標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下孵育5d,PBS沖洗,冷丙酮固定10min,晾干,-20℃儲(chǔ)存。1.5egfr-hrp反應(yīng)固定的爬片經(jīng)0.5%TritonX-100,3%H2O2處理,PBS清洗后,滴加正常山羊血清37℃溫育30min,棄去血清后滴加鼠抗人EGFR單抗,4℃過夜;滴加生物素化的山羊抗鼠IgG,37℃溫育30min,然后滴加S-A/HRP復(fù)合物37℃溫育30min,各步之間均以PBS充分振洗;最后滴加新鮮配制的DAB顯色液,室溫下7min,蒸餾水沖洗終止反應(yīng),蘇木精復(fù)染,逐級酒精脫水后二甲苯透明,中性樹膠封片。以正常山羊血清替代一抗作為陰性對照。1.6統(tǒng)計(jì)分析方法采用HMIAS-1000型全自動(dòng)醫(yī)學(xué)彩色圖像分析系統(tǒng)對染色結(jié)果進(jìn)行分析,每張蓋玻璃片上隨機(jī)選取5個(gè)視野,計(jì)算平均光密度值,采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS11.0進(jìn)行單因素方差分析和組間比較。2結(jié)果2.1原代細(xì)胞的生長特性第5天有細(xì)胞從組織塊周圍爬出,約15天左右細(xì)胞匯合可以傳代。原代細(xì)胞圍繞組織塊生長,兼有少量不規(guī)則細(xì)胞,以短梭形為主,胞核較大呈橢圓形;傳代后細(xì)胞生長成旋渦狀,大小形態(tài)趨于一致,成長梭形,有較長細(xì)胞突,胞漿豐富,胞核清晰可見。2.2周邊細(xì)胞生長的裝置鏡下可見同一處理液同一培養(yǎng)瓶中各蓋玻片上細(xì)胞數(shù)目不盡相同,蓋玻片上以周邊細(xì)胞生長旺盛,形態(tài)較好;rhBMP-2作用下細(xì)胞突變少,固定后細(xì)胞形態(tài)略有變形,但清晰可見細(xì)胞核,細(xì)胞漿和少量細(xì)胞突起。2.3染色深值分布400μg/L組可見胞漿中有大量棕黃色顆粒,尤以核膜周圍著色最深,見圖1;100μg/L組染色最淺,胞漿幾乎不著色,隱約可見淡黃色,相比下胞核的淺紫色較明顯,見圖2;對照組細(xì)胞數(shù)目較少,但細(xì)胞著色很深,呈明亮的黃色,見圖3。2.4圖像分析的統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示3成纖維表型細(xì)胞和成骨表型的變化rhBMP-2是目前已知的能單獨(dú)促進(jìn)干細(xì)胞向成骨方向分化的生長因子,在其作用下,多能干細(xì)胞的成骨表型上調(diào),ALP等成骨表型的標(biāo)記物表達(dá)增加,對于PDLC這種異質(zhì)性細(xì)胞,rhBMP-2也有同樣的作用,有些學(xué)者已經(jīng)在嘗試將rhBMP-2應(yīng)用于牙周組織再建,用以促進(jìn)新骨的生長。但是牙周組織是一個(gè)由軟硬組織組成的混合體,再建的牙周組織不應(yīng)全部是骨或者全部是軟組織,將牙周組織再生等同于牙槽骨再生是武斷的,因此有必要探討rhBMP-2作用下PDLC的成纖維表型的變化?？梢宰鳛镻DLC表型的標(biāo)記有很多,而Lin在分析PDLC群的異質(zhì)性時(shí)認(rèn)為PDLC群細(xì)胞可以分為兩大類,一類是具有成骨表型的細(xì)胞,以ALP,OPN等為標(biāo)記;一類是具有成纖維表型的細(xì)胞,以表達(dá)EGFR,Ⅻ膠原等為特征。少數(shù)學(xué)者認(rèn)為正常的牙周組織和體外培養(yǎng)的PDLC都不表達(dá)EGFR,但多數(shù)學(xué)者認(rèn)為EGFR有維持PDLC成纖維表型的功能,EGFR的變化反應(yīng)了PDLC成纖維表型的變化。本實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)組與對照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,說明rhBMP-2對PDLC的成纖維表型有影響,但EGFR的變化趨勢和rhBMP-2的濃度變化并不是直線依賴性的。在0～100μg/L的范圍內(nèi),EGFR的變化趨勢和rhBMP-2濃度是負(fù)相關(guān)的,當(dāng)rhBMP-2濃度為100μg/L時(shí),EGFR的表達(dá)最弱,當(dāng)rhBMP-2繼續(xù)升高EGFR的表達(dá)又有回升的趨勢,本實(shí)驗(yàn)可以看出rhBMP-2在100～400μg/L范圍內(nèi)EGFR的表達(dá)是上升的,見圖4。由EGFR表達(dá)的變化趨勢可以推測PDLC自身可能存在著某種調(diào)節(jié)機(jī)制使其在rhBMP-2濃度升高的情況下保持其成纖維表型,而這種機(jī)制可能就是由EGFR介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路。對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的進(jìn)一步分析還可以看出,在0～50μg/L的范圍內(nèi),EGFR表達(dá)強(qiáng)度下降的很快,而100～400μg/L范圍更大,變化的幅度卻小一些,推測小劑量的rhBMP-2即可對PDLC的成纖維表型發(fā)生顯著影響。PDLC成纖維表型是多年研究的熱點(diǎn),牙周膜能在牙槽骨和牙骨質(zhì)這兩種礦化組織間始終保持一定的寬度而不礦化,提示一定存在某種機(jī)制使成纖維表型和成骨表型達(dá)到了動(dòng)態(tài)平衡。馬良,劉宏偉等的研究發(fā)現(xiàn)在無任何礦化因子的誘導(dǎo)下,PDLC群內(nèi)具有鈣化能力的細(xì)胞占可以增殖細(xì)胞總數(shù)的38%,MatsudaN等也發(fā)現(xiàn)在礦化液的促進(jìn)下成骨標(biāo)志ALP的表達(dá)增加,而EGFR的表達(dá)下降,這些研究說明PDLC群內(nèi)成纖維表型細(xì)胞和成骨表型細(xì)胞是成比例的,且成纖維表型是PDLC群的優(yōu)勢細(xì)胞表型。通過礦化因素