秈型兩系水稻代換系耐冷性評(píng)價(jià)

秈型兩系水稻代換系耐冷性評(píng)價(jià)

水稻是一種喜熱作物，低溫冷害是水稻生產(chǎn)的主要障礙之一。全球每年約有0.15億hm2水稻受到寒冷脅迫,在南亞和東南亞約有700萬hm2面積因低溫影響不能種植現(xiàn)代水稻品種,我國(guó)每年因冷害損失稻谷30億~50億kg。水稻芽期和苗期冷害是我國(guó)長(zhǎng)江流域早稻區(qū)和云、貴、川一季中稻區(qū)生產(chǎn)中的重要影響因子,這些稻區(qū)在水稻生長(zhǎng)前期常遇寒潮襲擊,氣溫往往下降到15℃以下,非耐冷品種幼芽和幼苗停止生長(zhǎng),易導(dǎo)致爛秧、死苗或弱苗,抽穗分散,成熟期不一致,嚴(yán)重影響水稻生產(chǎn)。研究水稻在低溫脅迫下的耐冷機(jī)制,利用分子生物學(xué)的手段,培育耐冷水稻品種是解決水稻生產(chǎn)中冷害問題的重要途徑。水稻植株的耐冷性是一個(gè)復(fù)雜的數(shù)量性狀,且具有生長(zhǎng)階段的特異性。許多學(xué)者對(duì)水稻芽期和苗期耐冷性、耐冷機(jī)制和遺傳機(jī)理進(jìn)行了大量研究。Baruah等比較了57個(gè)栽培稻和普通野生稻的低溫發(fā)芽力、芽期和苗期耐冷性,發(fā)現(xiàn)粳稻芽期和苗期耐冷性明顯強(qiáng)于秈稻和普通野生稻,并利用RILs群體將粳稻Hokkaido芽期和苗期耐冷性QTL定位于第1、5、11、12染色體;Zhang等和陳瑋等利用Lemont/特青構(gòu)建的RIL群體,定位了4個(gè)芽期耐冷性QTL,其中qSCT-11為主效QTL(LOD=19.19);嚴(yán)長(zhǎng)杰等在南京11/巴利拉的DH群體中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與芽期耐冷性相關(guān)的基因(Cts7);喬永利等研究表明,粳稻吉冷1號(hào)的芽期耐冷性則由位于第2、4、7染色體上的2個(gè)部分顯性QTL和1個(gè)加性QTL控制。楊杰等和鞏迎軍等分別對(duì)Nipponbare/Kasalath//Nipponbare和Koshihikari/Kasalath//Koshihikari構(gòu)建的BILs群體,進(jìn)行芽期低溫處理,以處理后的活苗率作為評(píng)價(jià)指標(biāo),鑒定出4個(gè)來源于粳稻Nipponbare和Koshihikari的耐冷性QTL,4個(gè)來源于秈稻Kasalath的耐冷性QTL;Lin等也鑒定出4個(gè)來源于Nipponbare的芽期耐冷性QTL。Suh等則在苗期對(duì)溫帶耐冷粳稻Geumobyeo和熱帶粳稻IR66160-121-4-4-2構(gòu)建的RILs群體進(jìn)行耐冷性QTL分析,鑒定出2個(gè)位于第4染色體的耐冷性QTL。錢前等利用秈粳交DH群體將來自于粳稻京系17苗期耐冷性QTL定位于第1、2、3染色體,將來自于秈稻窄葉青8號(hào)苗期耐冷性QTL定位于第4染色體。Lou等通過將耐冷品種AAV002863與珍汕97B構(gòu)建的DH群體幼苗在6℃/10℃處理7d,分析恢復(fù)培養(yǎng)6d后的秧苗成活率,鑒定出5個(gè)LOD>4.0的主效耐冷性QTL;Koseki等將3葉期幼苗在4℃環(huán)境黑暗處理6d,對(duì)恢復(fù)培養(yǎng)后的生長(zhǎng)情況進(jìn)行分析,鑒定出3個(gè)苗期耐冷性QTL;Misawa等、Han等和夏瑞祥等也對(duì)水稻苗期的耐冷性進(jìn)行了研究,并進(jìn)行耐冷性QTL鑒定。但是利用同一群體研究芽期和苗期耐冷性的相互關(guān)系及遺傳效應(yīng)的報(bào)道較少,研究芽期和苗期耐冷性的遺傳機(jī)理,對(duì)選育芽期和苗期均耐冷的品種,解決水稻生產(chǎn)上爛種和爛秧的問題,具有重要意義。單片段代換系是進(jìn)行QTL定位的理想群體,它具有其他初級(jí)群體所不具有的優(yōu)點(diǎn),如群體穩(wěn)定,遺傳背景單一,無遺傳背景干擾等,把控制復(fù)雜性狀的QTL分解成單個(gè)孟德爾因子進(jìn)行分析,提高了QTL鑒定的準(zhǔn)確性。本研究利用測(cè)序品種(9311和日本晴)構(gòu)建的單片段代換系對(duì)水稻芽期和苗期耐冷性進(jìn)行分析,并進(jìn)行耐冷性QTL鑒定,旨在為進(jìn)一步研究耐冷基因及其遺傳機(jī)制,選育耐冷型兩系雜交稻新品種提供參考。1材料和方法1.1ssels—試驗(yàn)材料以秈型兩系骨干親本9311為受體親本,粳稻品種日本晴(Nipponbare)為供體親本構(gòu)建的遺傳穩(wěn)定的單片段代換系BC5F4(singlesegmentsubstitutionlines,SSSLs)為材料。代換系導(dǎo)入片段鑒定和遺傳背景篩選所用分子標(biāo)記為微衛(wèi)星標(biāo)記。該套代換系由123個(gè)株系組成,代換片段平均長(zhǎng)度為5.58Mb,全基因組覆蓋率為63.72%。本研究選用具有代表性的92個(gè)株系作為試驗(yàn)材料。1.2種子催芽處理水稻芽期耐冷性鑒定參照楊川航等的方法。將供試種子置于45℃烘箱中處理48h,常溫浸種48h,30℃下催芽24h;選取芽長(zhǎng)約5mm的健壯芽谷均勻置于墊有兩層濾紙的發(fā)芽皿中,每個(gè)發(fā)芽皿放置50粒,4次重復(fù),加水保持濕潤(rùn);將發(fā)芽皿放入4℃的恒溫冰箱內(nèi),黑暗處理10d;取出置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中恢復(fù)培養(yǎng)5d;調(diào)查各發(fā)芽皿中的恢復(fù)成活苗數(shù),計(jì)算恢復(fù)成活率(survivalseedlingrate)。將恢復(fù)成活率作為芽期耐冷性鑒定指標(biāo),其計(jì)算公式如下:恢復(fù)成活率(%)=(恢復(fù)成活苗數(shù)/出芽總粒數(shù))×100。水稻苗期耐冷性鑒定參照徐云碧等的方法進(jìn)行。將供試種子按上述方法正常催芽后,選取健壯芽谷播于孔徑為6cm、裝有濕潤(rùn)營(yíng)養(yǎng)土的育秧盤內(nèi),每個(gè)材料播3穴,每穴20粒;將秧盤置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至3葉期;取出置于13℃白天/7℃晚上環(huán)境下處理10d;調(diào)查供試材料的卷葉程度,以正常葉片率(normalleafrate,NLR)作為苗期耐冷性的鑒定指標(biāo)。正常葉片率(%)=(正常伸展葉片數(shù)/總?cè)~數(shù))×100。1.3農(nóng)藝性狀調(diào)查試驗(yàn)按NCⅡ設(shè)計(jì),2011年冬在海南選擇芽期和苗期耐冷株系用兩系不育系Y58S和隱性核不育系A(chǔ)BCG15進(jìn)行人工雜交,2012年正季將各組合F1種植于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)溫江試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng),種植與管理方式與大田相同,并進(jìn)行農(nóng)藝性狀調(diào)查,成熟后每小區(qū)選取有代表性的5株考種。1.4代換片段長(zhǎng)度計(jì)算采用SPSS數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行方差分析、相關(guān)分析及顯著性檢測(cè),用DPS2000數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)進(jìn)行配合力分析;QTL的鑒定按Zhu等的方法,通過t測(cè)驗(yàn)分析單片段代換系與受體親本(9311)間的差異顯著性,以P=0.001作為判定QTL存在的閾值;QTL加性效應(yīng)值的估算參照Eshed等的方法。QTL代換作圖參照Zhang等的方法;代換片段長(zhǎng)度的計(jì)算按Xi等的方法;QTL命名遵循McCouch等的規(guī)則。2結(jié)果與分析2.1期耐冷性表現(xiàn)單片段代換系對(duì)芽期低溫脅迫表現(xiàn)出不同的耐冷性(表1,圖1)。方差分析表明,代換系間芽期耐冷性差異達(dá)極顯著水平(F=6.987,P<0.001),芽期耐冷性表現(xiàn)出較大差異,并且表現(xiàn)為連續(xù)分布,表明芽期耐冷性為數(shù)量遺傳性狀。從恢復(fù)成活率上看,代換系X709、X712、X686和X729耐冷性較強(qiáng)(恢復(fù)成活率大于70.0%),耐冷性中等以上(恢復(fù)成活率大于50.0%)的代換系占34.0%。供體親本日本晴芽期耐冷性極強(qiáng),受體親本9311耐冷性較弱,雙親耐冷性差異極顯著(F=1080.310,P<0.001),粳稻親本日本晴芽期耐冷性明顯優(yōu)于秈稻親本9311及以9311為背景的單片段代換系。2.2不同品種水稻的抗冷性單片段代換系間苗期耐冷性也存在極顯著差異(F=12.632,P<0.001),苗期耐冷性表現(xiàn)為連續(xù)分布(表1,圖1),表明苗期耐冷性為數(shù)量遺傳性狀。正常葉片率數(shù)據(jù)表明,代換系X404、X634、X649、X732、X733和X738具有較強(qiáng)的苗期耐冷性(NLR>60.0%),耐冷性中等以上(NLR>50.0%)的代換系占21.74%。粳稻親本日本晴苗期耐冷性較強(qiáng),秈稻親本9311苗期耐冷性極弱,雙親間差異達(dá)極顯著水平(F=288.878,P<0.001)。粳稻親本日本晴苗期耐冷性明顯強(qiáng)于秈稻親本9311及以9311為背景的單片段代換系。相關(guān)分析表明(圖2),代換系芽期與苗期耐冷性相關(guān)性不顯著(r=-0.082,P=0.432),但也存在芽期和苗期耐冷性均較強(qiáng)的代換系,如X733芽期耐冷性和苗期耐冷性都較強(qiáng)(恢復(fù)成活率為57.5%,正常葉片率為66.7%)。2.3農(nóng)藝性狀表現(xiàn)對(duì)芽期(恢復(fù)成活率大于50%)和苗期(正常葉片率大于50%)均表現(xiàn)耐冷的5個(gè)代換系進(jìn)行了農(nóng)藝性狀分析(表2)。結(jié)果表明,代換系X719、X724和X733除穗長(zhǎng)顯著變化外,其余性狀與受體親本9311無顯著差異;代換系X704千粒重極顯著減小,其余性狀與9311無顯著差異;代換系X732株高和穗長(zhǎng)極顯著高于或長(zhǎng)于9311,其余性狀與9311相當(dāng),表明耐冷株系較好地保持了9311的農(nóng)藝性狀。對(duì)耐冷株系的配合力方差分析表明(表3),耐冷株系間在株高、結(jié)實(shí)率和產(chǎn)量配合力方面存在極顯著差異。將耐冷株系的主要農(nóng)藝性狀一般配合力(GCA)與9311比較(表4),發(fā)現(xiàn)代換系X704結(jié)實(shí)率GCA和產(chǎn)量GCA均極顯著低于9311;代換系X719和X733主要性狀GCA與9311無顯著差異,X733產(chǎn)量GCA較高;代換系X724株高GCA和結(jié)實(shí)率GCA顯著低于9311,但產(chǎn)量GCA高于9311;代換系X732株高GCA顯著高于9311,結(jié)實(shí)率GCA和產(chǎn)量GCA也較高。對(duì)主要農(nóng)藝性狀GCA的綜合比較發(fā)現(xiàn),代換系X724、X732和X733主要農(nóng)藝性狀GCA較強(qiáng),產(chǎn)量GCA突出,具有較大的育種利用價(jià)值。2.4qtl分析2.4.1代換系芽期耐冷性發(fā)展本研究共檢測(cè)到18個(gè)與芽期耐冷性相關(guān)的QTL,分布于除第1染色體外的11條染色體上(表5,圖3)。檢測(cè)到的QTL均為正向加性效應(yīng),且具有較大的加性效應(yīng),導(dǎo)入片段導(dǎo)致代換系芽期耐冷性增強(qiáng)。其中qCTP11.2加性效應(yīng)最大(a=29.5),對(duì)應(yīng)代換系平均恢復(fù)成活率達(dá)69.5%。另外,qCTP3.2、qCTP5.2、qCTP6、qCTP8、qCTP9、qCTP10.1、qCTP10.2、qCTP11.1、qCTP12.1和qCTP12.2加性效應(yīng)也較大(a>20),所在代換系相比9311具有較強(qiáng)的芽期耐冷性。2.4.2抗冷性能分析本研究中共檢測(cè)到5個(gè)苗期耐冷性QTL,分布于第1、7和12染色體(表6,圖3)。檢測(cè)到的QTL均為正向加性效應(yīng),且具有較大的加性效應(yīng)(a>30),其中qCTS1.1加性效應(yīng)最大(a=42.22),對(duì)應(yīng)代換系苗期NLR為90.0%,具有較強(qiáng)的苗期耐冷性。芽期耐冷性qCTP12.1和苗期qCTS12.1以及qCTP12.2和qCTS12.2定位在同一區(qū)間,且加性效應(yīng)均較大,表明利用分子標(biāo)記選育芽期和苗期均耐冷的品種是可行的,且芽期和苗期均耐冷的株系X732和X733分別含有qCTP12.1和qCTS12.1以及qCTP12.2和qCTS12.2。3耐冷性各體性基因檢測(cè)結(jié)果水稻秈粳亞種間的耐冷性具有較大差異,一般來源于熱帶的秈稻對(duì)低溫較為敏感,而來源于熱帶和溫帶的粳稻具有較強(qiáng)的耐冷性,但是由于秈粳亞種間的雜交親和性問題,粳稻中的耐冷基因很難被秈稻所直接利用。本研究利用回交和分子標(biāo)記輔助選擇的方法,通過測(cè)序品種秈稻9311和粳稻日本晴構(gòu)建單片段代換系,將粳稻耐冷基因?qū)攵i稻中,篩選出芽期和苗期耐冷性均較強(qiáng)的代換系X704、X719、X724、X732和X733。這些代換系較好地保持了9311的優(yōu)良農(nóng)藝性狀,其中X724、X732和X733綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良,在產(chǎn)量GCA方面表現(xiàn)突出,可作為改良秈稻耐冷性的優(yōu)良種質(zhì)和選育耐冷雜交稻的優(yōu)良親本。另外,耐冷單片段代換系僅有單一片段來自供體親本,其余背景與9311相同,因此,它們還是進(jìn)行耐冷基因定位,克隆和效應(yīng)分析的良好遺傳基礎(chǔ)材料,具有較大的應(yīng)用價(jià)值。本研究共檢測(cè)到18個(gè)芽期耐冷性QTL和5個(gè)苗期耐冷性QTL,檢測(cè)到的QTL中,芽期耐冷性QTLqCTP3.1、qCTP4.1、qCTP5.1、qCTP5.2和qCTP11.2分別與Zhou等、楊杰等、鞏迎軍等、Lin等和楊川航等定位的芽期耐冷性QTL在同一位點(diǎn),苗期耐冷性QTLqCTS1.1、qCTS1.2、qCTS7和qCTS12.2分別與Lou等、Andaya等和Han等檢測(cè)到的苗期耐冷性QTL在同一位點(diǎn)外,其余均為新檢測(cè)到的耐冷性QTL位點(diǎn)。研究還發(fā)現(xiàn),第3染色體芽期耐冷性QTLqCTP3.1所在的RM426-RM8277區(qū)域與Fujino等定位的低溫發(fā)芽力QTL,Han等定位的分蘗期耐冷性QTL在同一區(qū)域;第5染色體芽期耐冷性QTLqCTP5.2所在的RM3348-RM274區(qū)域與Xu等鑒定的孕穗期耐冷性QTL在同一區(qū)域;第7染色體苗期耐冷性QTLqCTS7所在的RM320-RM455區(qū)域與已報(bào)道的低溫發(fā)芽力QTL、芽期耐冷性QTL和生殖生長(zhǎng)期耐冷性QTL處于同一區(qū)域;第8染色體芽期耐冷性QTLqCTP8所在的RM22722-RM42區(qū)域、第9染色體qCTP9的RM410-RM201區(qū)域和第11染色體qCTP11.1所在的RM4-RM167區(qū)域存在與水稻多個(gè)生育時(shí)期耐冷性相關(guān)的QTL[5,20,24,39,41,42,43,44]。本研究中,第12染色體的RM1261-RM519區(qū)域和RM17區(qū)域,也同時(shí)檢測(cè)到芽期和苗期耐冷性QTL。這些染色體區(qū)域可能是多個(gè)生育時(shí)期耐冷性QTL成簇分布區(qū)域,也可能是多效耐冷性QTL位點(diǎn),這些區(qū)域和QTL的發(fā)現(xiàn)為了解水稻耐冷機(jī)制,研究耐冷基因,選育多生育時(shí)期耐冷品種提供參考。另外,分別將qCTP3.2、qCTP6、qCTP12.2和qCTS12.2定位于第3染色體RM85區(qū)域、第6染色體RM141區(qū)域、第12染色體RM17區(qū)域較小的染色體片段上(1.22Mb、0.89Mb、0.6Mb),且具有較大的加性效應(yīng)(a=25.00,25.03,23.50,30.56)。這些與芽期和苗期耐冷性緊密連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記可作為芽期和苗期耐冷品種的輔助選擇標(biāo)記,提高選育耐冷品種效率。水稻耐冷性具有群體和生育階段特異性,不同鑒定群體的耐冷性QTL不同,同一鑒定群體在不同生育階段的耐冷性QTL也不盡相同。本研究也表明水稻芽期與苗期耐冷性無顯著相關(guān)性,芽期和苗期耐冷性QTL較少在同一