診斷學-臨床常見病原體檢測

實驗診斷（LaboratoryDiagnosis）臨床常見病原體檢測感染性疾病的現(xiàn)狀感染性疾病的病原體：細菌、病毒、真菌、支原體、衣原體、立克次體以及寄生蟲等。自從抗生素的發(fā)現(xiàn)和預(yù)防接種的實施，許多曾嚴重危害人體健康的病原體已消滅或基本消滅新的傳染病陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，曾絕跡的老傳染病部分死灰復(fù)燃。條件致病菌感染比例增加。多重耐藥菌株不斷出現(xiàn)，真菌感染的幾率逐年增高。------臨床病原體檢查的重要性提綱第一節(jié)：標本的采集運送，實驗室評價和檢查方法第二節(jié)：病原體耐藥性檢測

藥敏檢測第三節(jié)：臨床感染常見病原體檢測第四節(jié)：病毒性肝炎檢測第五節(jié)：性傳播疾病病原體檢測

病原體檢測

第六節(jié)：醫(yī)院感染常見病原體檢測

臨床病原體檢查目的確定感染的發(fā)生和性質(zhì)早期診斷選擇治療方案預(yù)防措施防止廣泛傳播第一節(jié)

標本采集、運送和檢查方法一.標本采集和運送基本原則1：選擇標本的種類和采集部位并要反映有效病程2：采集和運送應(yīng)無菌操作，防止污染3：盡快送檢4：要視所有標本為傳染品

明顯標識

特別標注5：標本用后要消毒處理（一）血液適應(yīng)癥：疑為菌血癥、敗血癥和膿毒血癥患者。采血時間：一般在發(fā)熱初期、發(fā)熱前2小時或發(fā)熱高峰期采集，已用過抗菌藥物治療者，在下次用藥前采集。24小時內(nèi)采血標本3次，并在不同部位采集，可提高血培養(yǎng)陽性檢出率。采血量：成人10~20ml/次，嬰兒和兒童1~5ml。(二)尿

液無菌采集中段尿10~20ml于滅菌容器內(nèi)厭氧菌的培養(yǎng)，膀胱穿刺法排尿困難者可導(dǎo)尿，插入導(dǎo)尿后

留棄15ml后再留取標本

★尿液中注意不要加防腐劑（三）糞

便取含膿、血或粘液糞便置于清潔容器內(nèi)排便困難者或嬰幼兒可用直腸拭子懷疑霍亂引起腹瀉的糞便應(yīng)置于堿性蛋白胨水或卡-布運送培養(yǎng)液送檢傳染性腹瀉患者需

3

次送檢病原學明確診斷后，不同時間至少3次培養(yǎng)陰性出院（四）呼吸道標本采集時間：晨痰，且在取痰前用清水反復(fù)漱口方法（1）自然咳痰法；（2）氣管鏡下采集法；

（3）氣管穿刺法。符合要求痰標本：存在正常菌群，注意鑒別≤10鱗狀上皮/LPH及≥25個WBC/LPH（四）呼吸道標本注意事項痰標本采集后應(yīng)及時送檢和處理，最好不超過1小時，室溫下延擱數(shù)小時，定植于口咽部的非致病菌呈過度生長，導(dǎo)致檢出率明顯下降。另外上呼吸道存在正常菌群，在采集標本與結(jié)果分析時應(yīng)予考慮。（五）腦脊液與其他無菌體液腦膜炎病原體：腦膜炎奈瑟菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌等，抵抗力弱、不耐冷、易死亡，腦脊液標本應(yīng)立即保溫送檢或床邊接種胸腹水等體液標本應(yīng)接種于血培養(yǎng)瓶中感染患者腹膜透析液標本，至少需采集50ml。（六）生殖道標本性傳播疾病取尿道口分泌物、陰道宮頸口分泌物、前列腺液生殖道皰疹常穿刺取皰疹液，盆腔膿腫于直腸子宮凹陷處穿刺取膿淋病奈瑟菌保溫送檢，其余標本收集后4°C保存至培養(yǎng)，超過24h，應(yīng)凍存于-70°C（七）創(chuàng)傷、組織和膿腫標本損傷范圍大的創(chuàng)傷：不同部位多份標本，采集部位先清污、消毒，防止表面污染菌混入標本較?。杭訜o菌等滲鹽水開放性膿腫的采集：無菌棉拭子采膿液及病灶深部分泌物封閉性膿腫：穿刺抽取。疑為厭氧菌感染，應(yīng)隔絕空氣采集標本的實驗室質(zhì)量評估標準患者信息標本采集時間及送檢時間送檢容器完整性、是否污染貯存及運送方式不當個人防護檢查方法直接顯微鏡檢測病原體特異性抗原檢測病原體核酸檢測（PCRDNA探針）

初步診斷血清學實驗（查特異性抗體/抗原）病原體分離培養(yǎng)和鑒定

確定診斷

DiagnosisStrategyforBacterialInfection可疑細菌感染血清學診斷（雙份血清）特異性抗體檢測試管凝集沉淀反應(yīng)補體結(jié)合試驗采集標本細菌成分檢測抗原檢測核酸檢測凝集試驗協(xié)同凝集試驗乳膠凝集試驗ELISA免疫熒光檢測核酸雜交聚合酶鏈反應(yīng)直接形態(tài)學檢查細菌分離培養(yǎng)鑒定形態(tài)檢查生化反應(yīng)抗原檢測動物試驗（毒力）藥敏試驗直接顯微鏡檢測-涂片不染色標本涂片不染色：適用于檢查生活狀態(tài)下病原體的生長、

動力及運動方式、螺旋體的形態(tài)和運動方法：懸滴法、壓滴法或濕式涂片

置于暗視野或相差顯微鏡下觀察

直接顯微鏡檢測-涂片染色標本染色標本：光學顯微鏡下觀察細菌的形態(tài)。染色性或觀察宿主細胞內(nèi)包涵體的特征。方法：革蘭染色、抗酸染色、墨汁染色直接顯微鏡檢測-染色標本革蘭染色結(jié)果直接顯微鏡檢測-染色標本墨汁染色找新生隱球菌抗酸染色直接顯微鏡檢測——熒光顯微鏡檢查熒光顯微鏡用于標本經(jīng)熒光染色后直接檢出某些病原微生物直接顯微鏡檢測——免疫電鏡檢查SARS（severeacuterespiratorysyndrome)病原體的確定電鏡檢查不常規(guī)用于臨床，對某些病毒感染卻有確診的價值直接顯微鏡檢測——免疫電鏡檢查電子顯微鏡下發(fā)現(xiàn)為某種冠狀病毒直接顯微鏡檢測的意義無菌體液的直接鏡檢對病原體診斷具有一定意義對正常菌群寄居腔道的分泌物涂片鏡檢可提示進一步檢查的步驟、采取的方法和分離鑒定病原體所需培養(yǎng)基由于臨床標本中常含有一定濃度的抗菌物質(zhì)，以致分離培養(yǎng)可為陰性，此時的鏡檢所見往往可能在診斷上起重要作用熒光顯微鏡檢查用于標本經(jīng)熒光染色后直接檢出某些病原微生物電鏡檢查雖不常規(guī)應(yīng)用于臨床，但對某些病毒感染卻有確診的價值病原體分離培養(yǎng)和鑒定意義：分離培養(yǎng)是微生物學檢驗中確診的關(guān)鍵步驟。明確感染病原體；為臨床提供體外抗微生物藥物敏感試驗結(jié)果。培養(yǎng)基的選擇分離培養(yǎng)和鑒定病原體檢測方法病原學初步診斷（臨床癥狀、體征、鏡下檢查）選擇最合適的培養(yǎng)方法（適當?shù)呐囵B(yǎng)基、接種前的標本處理、確定孵育條件）分離菌的鑒定（菌落性狀和細菌的形態(tài)、染色性，細菌生化反應(yīng)結(jié)果，血清學實驗等）鑒定細菌的同時，需作抗生素的藥敏試驗

第二節(jié)

病原體耐藥性檢測病原體耐藥性檢測抗生素壓力（一）抗微生物藥物敏感性試驗（AST）抗微生物藥物敏感性試驗（antimicrobialsusceptibility,AST)對敏感性不能預(yù)測的臨床分離菌株進行藥敏試驗，以指導(dǎo)臨床選擇治療藥物和了解區(qū)域或醫(yī)院內(nèi)常見病原菌耐藥性變遷，有助于臨床經(jīng)驗性治療選藥。常用抗菌藥物敏感試驗的方法常用敏感性試驗的方法K-B紙片瓊脂擴散法（Kirby-Bauerdiscagardiffusionmethod)稀釋法（dilutiontest）E試驗（Etest）耐藥篩選試驗折點敏感試驗K-B紙片瓊脂擴散法K-B紙片瓊脂擴散法按敏感（Susceptible，S）、中度敏感（Intermediate，I）、耐藥（Resistant，R）報告。S：測試菌能被測定藥物常規(guī)劑量給藥后在體內(nèi)達到的血藥濃度所抑制或殺滅。I：

測試菌能被測定藥物大劑量給藥后在體內(nèi)達到的血藥濃度所抑制，或在測定藥物濃集部位的體液（如尿）中被抑制。R：測試菌不能被在體內(nèi)感染部位可能達到的抗菌藥物濃度所抑制。稀釋法Minimalinhibitoryconcentration（MIC）最小抑菌濃度：某些抗菌藥物抑制檢測菌肉眼可見生長的最低濃度稱為最小抑菌濃度EtestEtest應(yīng)用抗菌藥物塑料試條結(jié)合稀釋法和擴散法操作簡單、價格昂貴（二）耐藥菌監(jiān)測試驗由于細菌存在一種或幾種耐藥機制，造成了細菌的多重耐藥性。單一的藥敏試驗已不能完全表示細菌的耐藥性，必須進行一些特殊的耐藥性監(jiān)測試驗。1.耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）的篩選測定2.氨基糖苷類抗生素高耐藥腸球菌的篩選測定3.耐青霉素肺炎鏈球菌（PRSP）的篩選測定4.-內(nèi)酰胺酶檢測5.超廣譜-內(nèi)酰胺酶（ESBL）檢測第三節(jié)臨床感染常見病原體檢測

臨床常見病原體為：細菌、病毒、真菌、寄生蟲、支原體、衣原體以及立克次體等。檢查項目和臨床應(yīng)用——細菌感染細菌感染性疾病一般均需進行細菌學診斷以明確病因檢查方法：1、檢測細菌或抗原（直接涂片顯微鏡檢查、培養(yǎng)、抗原檢測與分析）2、檢測抗體3、核酸檢測（基因探針技術(shù)、PCR技術(shù)）

★

上述多種檢查手段中，細菌培養(yǎng)是最重要的確診方法檢查項目和臨床應(yīng)用——病毒感染病毒是只能在易感細胞內(nèi)以復(fù)制方式進行增殖的非細胞型微生物檢查方法：分離培養(yǎng)與鑒定、核酸或抗原的檢出及抗體的檢測

★細胞培養(yǎng)是最重要的分離方法檢查項目和臨床應(yīng)用——真菌感染真菌是以腐生或寄生方式攝取養(yǎng)料的真核細胞型微生物真菌的微生物學診斷手段：直接檢查、培養(yǎng)檢查、免疫學試驗和動物試驗檢查項目和臨床應(yīng)用——真菌感染真菌抗原檢測只使用于血清或腦脊液中隱球菌、念珠菌以及莢膜組織包漿菌等真菌血清學試驗：深部真菌感染檢查項目和臨床應(yīng)用——寄生蟲病直接顯微鏡檢查：觀察寄生蟲生活史的各階段，是寄生蟲感染的主要診斷依據(jù)寄生蟲免疫學方法：輔助診斷檢查項目和臨床應(yīng)用——其他病原體感染支原體：分離培養(yǎng)是確診依據(jù)。螺旋體：（除鉤端螺旋體外，均不能培養(yǎng)）檢測血清中的特異性抗體。立克次體：外裴氏試驗，血清采取發(fā)病1周、2周及4~6周。衣原體：檢查胞質(zhì)內(nèi)的包涵體。SARS：免疫學方法、基因檢測及細胞培養(yǎng)（是鑒別SARS感染最為準確的方法）第四節(jié)

病毒性肝炎檢測病原學及肝炎的命名HAV(RNA)甲型肝炎HBV(DNA)乙型肝炎HCV(RNA)丙型肝炎HDV(RNA)丁型肝炎HEV(RNA)戊型肝炎HGV(RNA)庚型肝炎TTV(DNA)輸血傳播病毒肝炎病毒性肝炎類型ABCDE傳染源糞便血液/血液/血液/糞便血源性物質(zhì)/血源性物質(zhì)/血源性物質(zhì)/

體液體液

體液傳播途徑糞-口經(jīng)皮膚/粘膜經(jīng)皮膚/粘膜

經(jīng)皮膚/粘膜

糞-口慢性感染否是是是否基因組類型ssRNAdsDNAssRNAssRNAssRNA

一.甲型肝炎病毒（HAV)

甲型肝炎病毒（HepatitisAvirus,HAV)屬微小的RNA病毒科，無包膜，核心為單股正鏈RNAHAV主要通過糞口途徑傳播病毒標志：HAVAg、抗HAV、HAV-RNA一.甲型肝炎病毒（HAV)臨床表現(xiàn)為急性黃疸肝炎二.乙型肝炎病毒（HBV)二.乙型肝炎病毒（HBV)HBV為乙型病毒性肝炎的病原體，血液為其主要的傳播途徑機體感染HBV后產(chǎn)生相應(yīng)的免疫反應(yīng)，形成多種不同的抗原抗體系統(tǒng)表面抗原抗體系統(tǒng)（HBsAg，抗HBs）核心抗原抗體系統(tǒng)（HBcAg,抗HBc）e抗原抗體系統(tǒng)（HBeAg,抗HBe）（1）HBsAgHBsAg是HBV的外殼，不含DNA，故HBsAg本身不具傳染性；但因其常與HBV同時存在，常被用來作為傳染性標志之一。HBsAg（+）表示：肝中有HBV

見于乙型肝炎潛伏期和急性期

慢性遷延性肝炎，慢性活動性肝炎，肝硬化，

肝癌，慢性HBsAg攜帶者。（2）抗-HBs抗-HBs是種保護性抗體，可阻止HBV穿過細胞膜進入新的肝細胞，陽性提示機體對乙肝病毒有一定程度的免疫力抗-HBs（+）表示：①既往曾感染過HBV，現(xiàn)已恢復(fù)；②接種乙肝疫苗后；③被動性獲得抗-HBs抗體（3）HBeAgHBeAg（+）表示：患有乙型肝炎，是病毒復(fù)制活躍，傳染性強的指標。HBeAg持續(xù)陽性的乙型肝炎，表示肝細胞損害較重，且可轉(zhuǎn)為慢性乙型肝炎或肝硬化。HBeAg（+），HBsAg（+）的孕婦可引起垂直傳播。（4）抗-HBe抗-HBe（+）意味著大部分HBV被清除，復(fù)制減少，傳染性減低，但并非無傳染性。乙肝急性期即出現(xiàn)抗-HBe陽性，易發(fā)展為慢性乙型肝炎。

慢性活動性肝炎出現(xiàn)抗-HBe陽性，可發(fā)展為肝硬化。e抗原與e抗體均陽性，且ALT升高可進展為原發(fā)性肝癌。（5）抗-HBc可分為IgM、IgG、IgA三型，目前常用的方法是檢測抗-HBc總抗體，抗-HBc總抗體主要反映的是抗-HBcIgG?？?HBc檢出率比HBsAg更敏感，可作為HBsAg陰性的HBV感染的敏感指標?？?HBc檢測也可用作乙型肝炎疫苗和血液制品的安全性鑒定和獻血員的篩選。臨床意義HBsAg——感染的標志Anti-HBs——既往感染/接種疫苗Anti-HBcIgM——急性感染標志Anti-HBcIgG——既往或慢性感染HBeAg——急性病毒復(fù)制，有傳染性Anti-HBe——病毒不再復(fù)制HBV-DNA——急性病毒復(fù)制，比HBeAg更準確，主要用于監(jiān)測治療反應(yīng)血清學檢測的臨床意義HBsAg

抗-HBsAgHBeAg抗-Hbe抗-HBc臨床意義+-+-+急性或慢性感染（大三陽）+--++乙肝后期或慢性感染（小三陽）+-+--潛伏期或急性乙肝早期-+-++痊愈或恢復(fù)期，有免疫力-+--+痊愈，有免疫力-+---疫苗接種或曾經(jīng)感染過，有免疫力乙型肝炎病毒表面抗原蛋白

前S1、前S2和前S1抗體、前S2抗體測定Pre-S抗原位于HBV的外衣殼上，有兩種刺激集體產(chǎn)生抗Pre-S1和抗Pre-S2，能阻斷HBV與肝細胞受體結(jié)合，從而起到抵抗病毒的作用抗Pre-S1和抗Pre-S2的出現(xiàn)，表示病情好轉(zhuǎn)，趨向痊愈三.丙型肝炎病毒（HCV)HCV為黃病毒屬、單鏈正股RNA病毒，由核心和包膜組成。血液為其傳播途徑病情雖較乙型肝炎輕，但更易轉(zhuǎn)為慢性抗-HCVIgM陽性

常見于急性HCV感染，是診斷丙肝的早期敏感指標；是HCV活動的指標，是判斷HCV傳染性的指標。

抗-HCVIgG陽性

表明體內(nèi)已有HCV感染，但不能作為感染的早期指標第五節(jié)性傳播疾病病原體檢測性傳播疾病病原體檢測性傳播疾病（sexuallytransmitteddisease,STD)簡稱性病，是一類能通過各種性接觸而傳播的侵犯皮膚、性器官及全身臟器損害的疾病。常見臨床類型

性病

病原體艾滋病

人類免疫缺陷病毒梅毒

梅毒螺旋體淋病

淋球菌非淋球菌尿道炎

沙眼衣原體、解脲支原體生殖器皰疹

單純皰疹病毒尖銳濕疣

人乳頭瘤病毒軟下疳

杜克雷嗜血桿菌重要的性病及診斷金標準

性病

診斷金標準

淋病

分離培養(yǎng)

梅毒

特異性抗體檢測

艾滋病

免疫印跡法與RT-PCR非淋球菌尿道炎

分離培養(yǎng)、鑒定生殖器皰疹

分離培養(yǎng)、鑒定

尖銳濕疣PCR