利瑪原甲藻毒性和毒素的多因子分析

利瑪原甲藻毒性和毒素的多因子分析

現(xiàn)在，感冒紅色潮已成為世界海洋環(huán)境的主題，主要影響人類健康、自然生態(tài)和海水養(yǎng)殖。其中,有毒藻形成的有害赤潮尤其令人關注。有毒赤潮藻能夠產生藻毒素,在貝類和魚類體內累積,并沿食物鏈傳遞,危害高營養(yǎng)級的海洋生物,甚至危及人類健康。常見的藻毒素包括麻痹性貝毒(ParalyticShellfishPoison),PSP)、腹瀉性貝毒(DiarrheticShellfishPoison,DSP)、神經(jīng)性貝毒(NeurotoxicShellfishPoison,NSP)、記憶缺失性貝毒(AmnesicShellfishPoison,ASP)和西加魚毒素(CiguateraFishPoison,CFP)等。其中,DSP毒素是近年來受到密切關注的一類藻毒素。在以往研究中,通常將DSP毒素分為三類:即酸性毒素大田軟海綿酸(Okadaicacid,OA)及其衍生物鰭藻毒素(Dinophysistoxins,DTXs),聚醚內酯類毒素(Pectenotoxins,PTXs)和帶有硫酸基團的聚醚類毒素(Yessotoxins,YTXs)。但是,后兩類毒素實際上不會導致腹瀉癥狀,而OA和DTX毒素能夠抑制絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶PP1和PP2A,從而誘導蛋白質的超磷酸化,不僅會使中毒患者出現(xiàn)腹瀉等癥狀,而且會誘導細胞凋亡,具有促進腫瘤形成的長期毒性效應。因此,OA和DTX等DSP毒素是水產品質量控制中需要密切關注的一類毒素,迫切需要開展全面的檢測和分析工作。但是,DSP標準毒素價格昂貴,這在很大程度上制約著對DSP毒素檢測和分析工作的開展。根據(jù)以往文獻報道,鰭藻屬(Dinophysis)和原甲藻屬(Prorocentrum)中的一些藻種能夠產生DSP毒素如Dinophysisfortii,D.acuminata,D.acuta,Dnorvegica,D.mitra,D.rotundata,D.tripos,D.caudata,D.hastate,D.sacculus和Prorocentrumlima、Pconcavum、P.redfieldi等。但鰭藻屬中藻種的培養(yǎng)非常困難,近年來雖然有所突破,但要依靠現(xiàn)有技術實現(xiàn)對鰭藻的大量連續(xù)培養(yǎng)仍然存在問題。因此,從實驗室培養(yǎng)的利瑪原甲藻中分離純化DSP毒素是獲取DSP毒素的重要來源。在我國,DSP毒素污染問題比較突出。對我國沿海貝類中毒素污染情況進行的調查顯示,遼東灣、膠州灣、萊州灣、秦皇島、福建等地沿海的貝類均有受到DSP毒素污染的報道。1998年9～10月渤海灣曾發(fā)生大面積赤潮,其原因種之一就是能夠產生DSP毒素的倒卵形鰭藻?？梢?在我國開展DSP毒素的研究非常重要。本文針對一株利瑪原甲藻(ProrocentrumlimaDodge),分析其毒素產生情況,并通過設計多因子實驗探討了溫度、鹽度和光照強度等環(huán)境因子對利瑪原甲藻生長的影響,以期獲得這株利瑪原甲藻的最適培養(yǎng)條件,為開展DSP研究奠定基礎。1材料和方法1.1中心和藻株利瑪原甲藻購自美國Bigelow海洋科學實驗室海洋浮游植物培養(yǎng)中心(Provasoli-GuillardNationalCenterforCultureofMarinePhytoplankton,CCMP),藻株編號CCMP1966。1.2天然海水的制備培養(yǎng)利瑪原甲藻所用的海水取自中國科學院海洋研究所水族樓,是經(jīng)沙濾處理后的青島匯泉灣天然海水,鹽度為31,pH為7.9±0.1,海水以0.45μm混合纖維濾膜過濾后,煮沸滅菌,并轉至高壓滅菌的錐形瓶內,添加f/2-Si培養(yǎng)液后,接入利瑪原甲藻,在20oC,4800lx下培養(yǎng),光暗比為12h︰12h。1.3毒素成分分析利瑪原甲藻毒性的測試采用小鼠腹腔注射法,用于毒性測試的昆明系小白鼠(體重為20g±1g)購自青島藥物研究所。取穩(wěn)定期的利瑪原甲藻培養(yǎng)液300mL,濾至玻璃纖維濾膜上,用剪刀剪碎后,加入甲醇/丙酮提取液(體積比40︰60,含0.3%乙酸)4mL,振蕩4min后,靜置提取過夜。提取液以8000r/min離心8min,取出上清液至10mL容量瓶中,重復提取一次,合并上清液,定容至10mL,置于-20oC保存。分別取0.9,3,5.1mL藻毒素提取液,氮氣吹干后,加入3mL1%吐溫-60試劑溶解后,分別取1mL腹腔注射3只小白鼠。對照組直接注射1%吐溫-60試劑。觀察其存活狀況24h。采用液-質聯(lián)用方法對利瑪原甲藻產生的毒素進行分析。將培養(yǎng)的利瑪原甲藻藻液200mL過濾到玻璃纖維濾膜上,剪碎,置于7mL離心管中,加入3mL酸化甲醇水提取液(甲醇:0.05mol/L乙酸=9︰1),振蕩1min后,置于超聲水浴中超聲處理10min,于4℃下靜置提取過夜,提取液8000r/min離心10min后,取上清液以0.22uf06dm濾膜過濾,濾液用于分析DSP毒素成分。毒素分析采用美國熱電公司(ThermoFinnigan,SanJose,CA,USA)制造的LC-MS系統(tǒng),其中HPLC系統(tǒng)配備低壓混合四元泵和自動進樣器,質譜檢測器為FinniganLCQTMDecaXPPlus離子阱檢測器,配備ESI離子化源。通過OA標準毒素的流動注射分析,優(yōu)化質譜檢測器參數(shù)為:毛細管溫度275oC,離子噴射電壓3.0kV,鞘氣流35arb毛細管電壓23V,入口透鏡電壓為-74V,透鏡電壓為-18V,電子管透鏡補償為25V,多孔補償電壓1為-4.5V,多孔補償電壓2為-9.5V,多孔射頻振幅為400Vp-p。采用選擇離子檢測(selectiveionmonitoring,SIM)方式,在陽離子檢測模式下檢測OA和DTX1,每一毒素分別檢測三種陽離子,質荷比分別為[OA+H]+:805.0;[OA+NH4]+:822.0;[OA+Na]+827.0;[DTX1+H]+:819.0;[DTX1+NH4]+:836.0[DTX1+Na]+:841.0。用于分離OA和DTX毒素的色譜柱為PhenomenexLunaC18柱(150×2.0mm,3μm100?),配備C18保護柱套(PhenomenexATO-42874×3mm)。采用兩相洗脫液,洗脫液A為水溶液,含有2mmol/L甲酸和50mmol/L甲酸銨,洗脫液B為95%乙腈溶液,含有2mmol/L甲酸和50mmol/L甲酸銨。用30%洗脫液A和70%洗脫液B等梯度洗脫流速150uf06dL/min。樣品注射量10μL。用于對比的OA和DTX1標準毒素分別購自加拿大國家科學院海洋生物學研究所和日本。1.4多因子影響實驗實驗于中國科學院海洋研究所水族樓實驗室進行。選擇溫度、鹽度和光照三種環(huán)境因子,根據(jù)這株利瑪原甲藻分離地環(huán)境條件及實驗室條件,對三種因子分別選取三個水平,其中溫度為18、21和24oC鹽度為28、32和36,光照強度為2500、5000和7500lx,進行多因子影響實驗,總計27個處理組,每組設置三個重復。實驗在人工光照培養(yǎng)箱內進行,容器為100mL玻璃錐形瓶,事先經(jīng)高壓滅菌消毒。實驗中所用的不同鹽度海水是通過以蒸餾水稀釋天然海水、或向天然海水中補加氯化鈉獲得。接種用的利瑪原甲藻為處于對數(shù)生長期中期的藻,其中,用于接種不同鹽度實驗組的藻預先在各實驗鹽度下進行適應培養(yǎng)后再用于接種。對各處理組中的利瑪原甲藻進行觀察,并從培養(yǎng)當天(0天)開始取樣計數(shù),此后每隔2天取樣一次樣品以魯格試液(Lugol’ssolution)固定后,在顯微鏡下用浮游植物計數(shù)框計數(shù),記錄細胞密度,并計算細胞比增長率μ:其中:Bt1和Bt2分別是培養(yǎng)t1和t2天后的細胞密度,t1和t2為培養(yǎng)天數(shù)。1.5利瑪原甲藻的生長顯著性分析應用多因素方差分析方法對實驗數(shù)據(jù)進行處理,通過F檢驗分析各環(huán)境因子不同處理水平對利瑪原甲藻生長影響的顯著性,按概率(P<0.05)設置顯著性檢驗閾值。2結果分析2.1利瑪原甲藻的數(shù)字質譜檢測通過小鼠生物測試法對培養(yǎng)利瑪原甲藻的DSP毒性進行了測試。結果如表1所示,注射利瑪原甲藻提取液的實驗組都有小鼠死亡現(xiàn)象出現(xiàn),而且,隨著毒素提取液注射量的增加,死亡小鼠比例增加。實驗中對照組小鼠未死亡?？梢钥闯?培養(yǎng)的利瑪原甲藻具有DSP毒性,可能產生DSP毒素。根據(jù)實驗結果,實驗組2(注射1.0mL提取液)毒性最接近1個鼠單位,以此計算,每100mL培養(yǎng)液中利瑪原甲藻的毒性應在3.3MU(mouseunit,鼠單位)左右。應用液-質聯(lián)用分析方法,通過與OA和DTX1標準毒素進行對比,對利瑪原甲藻提取液中的OA和DTX1毒素進行了分析,得到色譜圖如圖1所示?？梢钥闯?在利瑪原甲藻提取液中存在OA和DTX1毒素。在針對每一毒素的三種陽離子檢測結果中,質荷比為827.0和841.0的陽離子[OA+Na]+和[DTX1+Na]+信號最高,而另外兩種陽離子的信號較弱。對比OA和DTX1標準毒素,計算得到每100mL培養(yǎng)的利瑪原甲藻中,OA和DTX1的含量分別為2.2鹽度和光照對利瑪原甲藻生長的影響采用比增長率作為指標,比較了不同水平的溫度、鹽度和光照強度等環(huán)境因子對利瑪原甲藻生長的影響,結果如圖2所示。應用多因素方差分析方法對實驗結果進行了統(tǒng)計分析(表2),可以看出,在三種環(huán)境因子中,只有不同水平的鹽度對利瑪原甲藻的生長具有顯著影響(F值為5.45,大于F0.05(2,54)=3.16),對于不同水平的鹽度處理組,鹽度為28時利瑪原甲藻的比增長率最高,達到0.18,而當鹽度分別為32和36的時候,平均比增長率為0.16。溫度和光照實驗各水平對利瑪原甲藻生長的影響沒有顯著差異(F值分別為1.74和1.69,小于F0.05(2,54)=3.16)但低溫(18oC)和高光照(7500lx)下,利瑪原甲藻表現(xiàn)出了較高的比增長率,分別達到0.18和0.17。此外溫度和鹽度及溫度和光照強度之間的交互作用對利瑪原甲藻的生長也有顯著影響,而鹽度和光照強度之間的交互作用沒有顯著影響,三者之間的交互作用對利瑪原甲藻的生長也沒有顯著影響。3利瑪原甲藻的生長和環(huán)境因子之間的關系利瑪原甲藻是一種重要的DSP產毒藻。但是,目前國內對于利瑪原甲藻的研究開展的并不多本實驗初步分析了一株利瑪原甲藻的毒性情況,并研究了溫度、鹽度和光照強度等環(huán)境因子對利瑪原甲藻生長的影響,以期建立最適培養(yǎng)條件,為利瑪原甲藻的培養(yǎng)和DSP毒素研究提供依據(jù)。實驗中通過小鼠生物測試法和液-質聯(lián)用分析方法,確定了所培養(yǎng)的利瑪原甲藻具有腹瀉性貝毒毒性,并檢出了OA和DTX1兩種DSP毒素成分。對于其他可能存在的DSP毒素,由于缺少標準毒素在此未作分析。目前,DSP小鼠生物測試法還是一種半定量的毒性測試方法,無法給出準確的毒性測試結果。但是,根據(jù)本實驗的毒素分析和毒性測試結果計算,每100mL培養(yǎng)的利瑪原甲藻中所含有的OA和DTX的量,其毒性約為2.8MU,與小鼠生物測試法所得到的結果大致相當,表明OA和DTX1應當是利瑪原甲藻所產生的主要毒素成分。由于利瑪原甲藻是一種底棲或附生性海洋甲藻極少形成高密度藻華,因此,對于其生長及其與環(huán)境因子之間的關系研究不多。在野外調查中發(fā)現(xiàn),利瑪原甲藻的豐度表現(xiàn)出一定的區(qū)域和季節(jié)差異。Carlson和Tindall在VirginIslands的調查發(fā)現(xiàn),利瑪原甲藻豐度的變化和溫度有正相關性。Morton等對從美國佛羅里達州采集的利瑪原甲藻進行培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)利瑪原甲藻的最適溫度是27oC,最適鹽度為30,最適光照強度為10%全日光,有關最適溫度的實驗結果與本文有明顯不同。本實驗中利瑪原甲藻(CCMP1996株)的最適溫度為18oC,最佳生長鹽度為28,而光照強度為7500lx。但是,在各因子的實驗范圍內,不同水平的溫度和光照對于利瑪原甲藻的生長并沒有顯著影響。由于本實驗所用的利瑪原甲藻采自緬因灣海域,水溫偏低,因此,實驗結果的差異可能是藻株對其生長環(huán)境長期適應的結果。利瑪原甲藻是底棲性或附生性甲藻,盡管在實驗培養(yǎng)過程中,有一部分藻細胞處于浮游狀態(tài),但仍有相當一部分藻細胞結合在一起,呈絮狀或網(wǎng)狀附著在錐形瓶底,給實驗過程中的取樣和計數(shù)帶來了很大的困難。以往文獻曾報道有多種能夠反映藻類生長的指標,如細胞顯微計數(shù)、葉綠素a分析、分光光度法(比濁法)、庫爾特計數(shù)法、流式細胞儀計數(shù)等,但這些指標在應用于利瑪原甲藻生物量測定時都存在一定的問題,葉綠素a含量測定耗時長,不利于連續(xù)測定;而分光光度法和其他幾種計數(shù)方法都會不同程度地受到絮狀結塊的利瑪原甲藻細胞影響,降低測定結果的準確性。為盡可能準確反映利瑪原甲藻生長的情況,我們選擇了傳統(tǒng)的顯微計數(shù)方法,同時在取樣時振搖錐形瓶,并用原培養(yǎng)液沖洗幾次培養(yǎng)瓶,增加對每組實驗的計數(shù),以盡量降低取樣和計數(shù)誤差。此外,實驗過程中發(fā)現(xiàn),在藻細胞培養(yǎng)初期,培養(yǎng)液中藻細胞密度相對較低計數(shù)結果受誤差影響較大,重現(xiàn)性低。進入對數(shù)生長期后,隨著藻細胞密度的逐漸增加,取樣和計數(shù)誤差對計數(shù)結果的影響有所降低。因此,為盡可能降低取樣和計數(shù)誤差的影響,比增長率的計算都選在對數(shù)生長初期進行,也就是從接種后一周左右開始計算此后10天