動物遺傳學(xué)實驗課件

實驗一外周血淋巴細胞培養(yǎng)及染色體標(biāo)本制作動物遺傳學(xué)實驗掌握兔外周血細胞常規(guī)核型的標(biāo)本制備方法熟悉外周血淋巴細胞培養(yǎng)方法一、目的與要求

二、實驗原理PHA秋水仙素低滲、固定、滴片、染色三

實

驗

流程7mlCarnoy液15min7mlCarnoy液15min固定重固定制備細胞懸液滴片、晾干、染色加0.2ml新選固定液視細胞量離心并棄上清綜合培養(yǎng)基配置（嚴(yán)格無菌）采血、接種（嚴(yán)格無菌）預(yù)熱的0.075MKCl低滲處理預(yù)固定37℃水浴16min1mlCarnoy1000r/min10min收集細胞于10ml離心管1500r/min10min離心離心并棄上清1000r/min10min離心并棄上清1000r/min10min培養(yǎng)秋水仙素處理鏡檢1、綜合培養(yǎng)基配置RMPI16404ml供給細胞營養(yǎng)，促進細胞增殖的基礎(chǔ)物質(zhì)小牛血清1ml提供基本營養(yǎng)物質(zhì)和各種生長因子PHA3mg/5ml細胞刺激劑雙抗各25IU/ml防止細胞污染肝素1.5IU/ml抗凝注意事項：在超凈臺內(nèi)工作，嚴(yán)格無菌，防止細胞污染四、具體步驟2、采血采血動物：兔采血部位：耳緣靜脈抗凝劑：肝素注意事項：采血過程中嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作；采血時，注意不要加入太多的肝素，因為肝素過多時可能引致溶血和抑制淋巴細胞的轉(zhuǎn)化和分裂，但肝素量也不應(yīng)過少，以免采血時發(fā)生凝血現(xiàn)象或培養(yǎng)物出現(xiàn)纖維蛋白形成的膜狀結(jié)構(gòu)。3、接種0.3～0.5ml血/5ml培養(yǎng)基注意事項：接種過程中嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作。4、細胞培養(yǎng)39℃的恒溫箱中培養(yǎng)68-70h注意事項：培養(yǎng)時，必須將瓶口塞緊，以免培養(yǎng)液的pH發(fā)生較大的變化。5、秋水仙素處理

在終止培養(yǎng)前2-3小時，開始滴加秋水仙素，使得最終濃度為0.24μg/ml，搖勻，放回恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。秋水仙素處理不當(dāng):如秋水仙素質(zhì)量有間題或秋水仙素的濃度、處理時間不夠或處理不合適，結(jié)果分裂相少;如果秋水仙素濃度過高或處理時間過長，則使染色體過于縮短，難以進行分析。注意事項：6、收集細胞由恒溫培養(yǎng)箱取出培養(yǎng)瓶，用吸管將瓶壁上的細胞輕輕沖散均勻，并用吸管移至離心管內(nèi)。以1500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。離心速度不合適:如果從培養(yǎng)瓶收集細胞迸行離心時的速度太低，則細胞多被丟失。注意事項：7、低滲

培養(yǎng)后的細胞經(jīng)低滲處理后，使紅細胞破碎，白細胞膨脹，染色體分散而有利于觀察。7mL預(yù)溫39℃的0.075MKCl溶液處理16min低滲處理不當(dāng)：低滲處理時間過長時，細胞膜往往過早破裂，引致分裂細胞丟失，或染色體丟失；如果處理時間不足時，細胞膨脹不夠，則染色體分散不佳，難以進行染色體計數(shù)分析。離心速度不合適:如果低滲后離心速度過高，則往往使分裂細胞過早破裂，分散良好的分裂相多被丟失，以致制出的標(biāo)本中分裂相少或大部分為剩余的分散不好為分裂相。注意事項：8、固定卡諾固定液（甲醇：冰醋酸=3:1）預(yù)固定1mL1min第一次固定7mL1min第二次固定7mL1min

固定是組織、細胞或其成分選擇性地固定于某一特定階段的過程。其目的是殺死細胞但又要避免所研究的成分受到破壞。注意事項：現(xiàn)配現(xiàn)用混勻使用標(biāo)本固定不充分:如固定液不新鮮，或甲醇、冰醋酸的質(zhì)量不佳，此時，染色體形象模糊，染色體周圍有胞漿背景。9、制片

留固定液0.2ml～0.4ml，輕輕沖打制成細胞懸液。冰凍載波片，滴管口距離載玻片10～15cm，每片2～3滴。載玻片：去油、冷凍玻片去油不徹底：玻片有油跡時，將使滴上的細胞懸液不能均勻分散，且將使細胞隨液滴流動而丟失。玻片冷凍不夠：合適的冰濕載玻片，從冰水中拿出時，玻片一表面浮霜，如冷凍不夠則無此現(xiàn)象，此時細胞難以貼附而可能造成丟失。注意事項：10、染色

用磷酸緩沖液稀釋Giemsa（20∶1）原液染色10-15分鐘，然后用自來水沖洗，晾干。Giemsa染液須現(xiàn)配現(xiàn)用注意事項：11、鏡檢

先用低倍鏡尋找良好的分裂相，再用高倍油鏡觀察。五、實驗結(jié)果實驗二人類染色體核型分析一、目的與要求

理解染色體組型分析的各種數(shù)據(jù)指標(biāo)掌握染色體組型分析的基本方法二、實驗原理染色體組型又稱核型，是指將動物、植物、真菌等的某一個體或某一分類群（亞種、種、屬等）的體細胞內(nèi)的整套染色體，按它們相對恒定的特征排列起來的圖像。核型圖是指將一個染色體組的全部染色體逐個按其特征繪制下來，再按長短、形態(tài)等特征排列起來的圖像。三、組型分析方法

1、染色體自動分析系統(tǒng)圖像處理病案信息編輯系統(tǒng)啟動染色體核型分析報告輸出2、Photoshop軟件處理3、手工操作（本實驗方法）分組排隊原則著絲粒類型相同，相對長度相近的分一組同一組的按染色體長短順序配對排列各指數(shù)相同的染色體配為一對可根據(jù)隨體的有無進行配對將染色體按長→短排隊，短臂向上人類染色體的編組和各組染色體的特征（Denver體制）組編號大小著絲粒位置副縊痕隨體鑒別難易備注A1～3最大1,3中央2亞中1號q常見無可鑒別

B4～5較大亞中

無不易短臂較短C6～12+X中等亞中9號q常見無難6、7、8、11號短臂較長，9、10、12短臂較短。D13~15中等近端

有難

E16~18較小16中央17,18亞中16號q常見無可鑒別18號短臂比17較短F19~20小中央

無不易

G21~22+Y最小近端

21,22有Y無不易，可鑒別Y21號〈22號，長臂分開，Y長臂平行1、計數(shù)：取正常人體細胞染色體照片，先劃分若干個區(qū)，分別計數(shù)，然后相加，計數(shù)結(jié)果，染色體的數(shù)目為46條。2、剪貼：將照片上的染色體逐個剪下放好。注意小心操作切勿丟失染色體。四、實驗步驟3、配對分組：將剪下的染色體按照Denver體制區(qū)別，正常人染色體可配成23對，分成A、B、C、D、E、F、G7組，分別配對。然后貼在試驗報告單上。粘貼以前先在紙上畫好各組染色體排列的橫線，并注明組別和染色體序號。然后將染色體的短臂朝上，長臂朝下，貼在相應(yīng)組的相應(yīng)位置上。性染色體單獨列為一組4、調(diào)整：在分組配對的基礎(chǔ)上仔細推敲你所排列的順序，是否符合上述各組的特征。如有不當(dāng)，應(yīng)作調(diào)整，直至最佳。

5、標(biāo)明染色體的核型(核型描述)列出染色體總數(shù)，然后是性染色體組成，列出異常的染色體數(shù)目或形態(tài)。下列統(tǒng)一的命名符號：A-G染色體組的名稱1-22染色體編號X,Y性染色體del缺失der結(jié)構(gòu)重排的染色體dup重復(fù)inv倒位t易位+/-在染色體符號前表示染色體增加或減少，在染色體符號后表示染色體多出或缺少一部分五、實驗結(jié)果13141516171867891011121234519202122XYABCDEFG人類染色體核型（46，XY）實驗三動物細胞DNA的提取

掌握動物細胞DNA的提取過程，為基因和基因組的研究提供基本材料。一、實驗?zāi)康亩?、實驗原?/p>

真核生物的DNA是以染色體的形式存在于細胞核內(nèi)，因此，制備DNA的原則是既要將DNA與蛋白質(zhì)等分離，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般過程是將分散好的組織細胞在含十二烷基硫酸鈉（SDS）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白質(zhì)，再用酚和氯仿/異戊醇抽提分離蛋白質(zhì)，得到的DNA溶液經(jīng)乙醇沉淀使DNA從溶液中析出。三、主要藥品、試劑

1.十二烷基硫酸鈉（SDS）：可破壞細胞膜、核膜，使組織蛋白與DNA分離。2.EDTA(乙二胺四乙酸)：使DNA酶失活。3.蛋白酶K：降解蛋白質(zhì)、使DNA分子完整地分離出來。4.酚和氯仿/異戊醇：分離蛋白質(zhì)，抽提DNA。5.Tris飽和酚：分離蛋白質(zhì)、要避光保存。

四、主要儀器

●冷凍離心機●電熱恒溫水浴鍋

●紫外分光光度計五、實驗步驟

從兔子的耳靜脈采取500μl血樣，放入含有抗凝劑的1.5毫升的離心管中，加入等體積PBS緩沖液，搖勻，5000rpm4℃離心5min，棄上清液，共重復(fù)3次

加500μl細胞裂解液，充分混勻后加入5μl蛋白酶K

（終濃度為100μg/mL），55℃水浴，過夜消化

加入等體積的Tris-飽和酚（約500μl），搖晃20分鐘后，使蛋白質(zhì)充分析出后，13000rpm離心5min轉(zhuǎn)移上清液，加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25:24:1）搖5in，13000rpm離心5min轉(zhuǎn)移上清液，加入等體積的氯仿：異戊醇（24:1）搖5in，13000rpm離心5min取上清，加入2.5倍體積的預(yù)冷的無水乙醇，可看到絮狀沉淀，放置5min，沉淀DNA棄上清，加75%的乙醇洗一次，輕輕搖晃后，13000rpm離心5min加入30μl的ddH2O55℃水浴溶解5min

操作過程中注意事項1.DNA提取的過程中所用的工具必須滅菌，防止污染。2.抽提過程中用大口徑的吸頭，減少對DNA的機械損傷。3.避免過酸、過堿對DNA結(jié)構(gòu)的破壞。4.減少物理因素對DNA的損傷，如機械剪切力、劇烈攪拌和高溫等。5.所獲DNA沉淀不要完全干燥，否則很難溶解。六、實驗結(jié)果

1紫外分光光度計檢測所得DNA的濃度

得到整齊一致的DNA條帶，表明本次試驗從動物細胞中提取到基因組DNA符后續(xù)試驗的質(zhì)量要求。

瓊脂糖凝膠電泳檢測實驗四瓊脂糖凝膠電泳一、實驗?zāi)康恼莆窄傊悄z電泳的基本原理和操作方法。二、實驗原理

瓊脂糖凝膠電泳可用于分離，鑒定和純化DNA片段。瓊脂凝膠作為支持物,利用DNA分子在泳動時的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng),達到分離混合物的目的。不同大小的DNA分子在相同的電泳條件下(如凝膠濃度、電流、電壓、緩沖液等)，有不同的遷移率，所以可通過電泳使其分離。凝膠中的DNA可與熒光染料溴化乙錠(EB)結(jié)合，在紫外燈下可看到熒光條帶，用于分析實驗結(jié)果。不同濃度的瓊脂糖可以分離不同長度范圍的DNA分子。

如：0.3%的瓊脂糖凝膠可以分離5-60Kb長度的DNA，而2%的瓊脂糖可以分離0.1-3kb的DNA分子。由于DNA帶負電荷，遷移率與分子量對數(shù)成反比。瓊脂糖濃度（%）分離范圍（kb）

0.35-600.61-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-42.00.1-3三、主要的實驗器材●

瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)●紫外成像凝膠分析系統(tǒng)操作過程中注意事項1.給膠板中倒入凝膠時，避免氣泡，否則會影響電泳效果。2.加樣量的多少依梳孔大小而定，過多會導(dǎo)致拖尾和彌散。3.電泳使要加入DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物。4.制膠緩沖液應(yīng)和電泳系統(tǒng)中的緩沖液濃度保持一致。5.制膠時一定要溶解徹底，凝膠溶液要成透亮，一定要加入

EB。6.電泳時要蓋好電泳槽，防止液體蒸發(fā)。四、操作步驟

1.瓊脂糖凝膠的制備制作1%的凝膠：稱取0.3克的瓊脂糖凝膠置于30ml0.5×TAE緩沖液中，加熱后使瓊脂糖完全溶解，待冷卻后，加入2μlEB。2.凝膠板的制備將制備好的液體瓊脂糖凝膠倒入制備好的膠槽中，凝固30min，拔出梳子，給電泳槽中加入緩沖液。

3.樣品的制備：將待測樣品和加樣緩沖液以6:1的比例混合均勻，加入點樣空。

4.加樣：加樣端為負極5.電泳：根據(jù)電泳槽的長度決定適當(dāng)?shù)碾妷骸．?dāng)溴酚藍染料移動到距凝膠邊緣1~2cm處，停止電泳6.觀察：紫外燈下觀察，照相

通過瓊脂糖凝膠電泳，使不同大小的DNA分子有效分離

實驗五兔SRY基因PCR擴增一、實驗?zāi)康?/p>

●掌握兔SRY基因的擴增方法，實現(xiàn)家兔性別的快速鑒定。

●掌握PCR擴增的基本原理和操作方法。二、實驗原理

SRY基因（sex-relatedY）：是性別決定基因，位于Y染色體上，在雄性兔子基