【1】生物樣本中蛋白質(zhì)的提取及測定(分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn))

實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文檔文案大全《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)名稱：生物樣本中蛋白質(zhì)的提取及測定姓名：杰學(xué)號：3140104666組別：同組同學(xué)：唐曦帶教教師：偉俞萍實(shí)驗(yàn)日期：2015年9月15日目錄1.原理： 31.1生物樣本中蛋白質(zhì)的提取 31.2生物樣本中蛋白質(zhì)的測定 31.2.1Lowry法 31.2.2考馬斯亮藍(lán)法 31.2.3紫外吸收法 42.操作步驟 42.1生物樣本中蛋白質(zhì)的提取 42.2生物樣本中蛋白質(zhì)的測定 42.2.1Lowry法 42.2.2考馬斯亮藍(lán)法 52.2.3紫外吸收法 53、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 53.1原始數(shù)據(jù) 53.1.1Lowry法 53.1.2考馬斯亮藍(lán)法 63.1.3紫外吸收法 63.2數(shù)據(jù)處理 73.2.1Lowry法 73.2.2考馬斯亮藍(lán)法 83.2.3紫外吸收法 94.討論： 101.原理：1.1生物樣本中蛋白質(zhì)的提取離體不久的組織，在適宜的溫度及pH等條件下，可以進(jìn)行一定程度的物質(zhì)代謝。因此，在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中，常利用離體組織來研究各種物質(zhì)代謝的途徑與酶系作用，也可以從組織中提取各種代謝物質(zhì)或酶進(jìn)行研究。但生物組織離體過久，其所含物質(zhì)的含量和生物活性都將發(fā)生變化。例如，組織中的某些酶在久置后會發(fā)生變性而失活；有些組織成分如糖原、ATP等，甚至在動物死亡數(shù)分鐘至十幾分鐘，其含量即有明顯的降低。因此，利用離體組織作代謝研究或作為提取材料時(shí)，都必須迅速將它取出，并盡快地進(jìn)行提取或測定。一般采用斷頭法處死動物，放出血液，立即取出實(shí)驗(yàn)所需的臟器或組織，除去外層的脂肪及結(jié)締組織后，用冰冷的生理鹽水洗去血液（必要時(shí)可用冰冷的生理鹽水灌注臟器以洗去血液），再用濾紙吸干，即可用于實(shí)驗(yàn)。取出的臟器或組織，可根據(jù)不同的方法制成不同的組織樣品。包括組織糜、組織勻漿、組織浸出液。由于動物肝臟細(xì)胞比較脆弱，易于破碎，故本實(shí)驗(yàn)選用小鼠肝臟細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料，采用勻漿法法將其破碎，然后加入樣品提取液使蛋白質(zhì)溶解，用高速離心法棄去細(xì)胞碎片。收集上清液后可進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析。1.2生物樣本中蛋白質(zhì)的測定1.2.1Lowry法1921年，F(xiàn)olin發(fā)明了Folin-酚試劑法測定蛋白質(zhì)的濃度，反應(yīng)原理是利用蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸和色氨酸殘基還原酚試劑（磷鎢酸-磷淚酸）生成藍(lán)色化合物；1951年Lowry對上述方法進(jìn)行了改進(jìn)，讓蛋白質(zhì)先與堿性銅試劑進(jìn)行反應(yīng)，然后再與酚試劑反應(yīng)，改進(jìn)后的方法可以使反應(yīng)的靈敏度提高。蛋白質(zhì)中的肽鍵在堿性溶液中能與銅離子結(jié)合形成復(fù)雜的紫色或紫紅色絡(luò)合物（類似雙縮脲反應(yīng)）。由于蛋白質(zhì)中芳香族氨基酸殘基(酪氨酸）的存在，該絡(luò)合物在堿性條件下進(jìn)而與Folin-酚試劑形成藍(lán)色復(fù)合物。上述呈色反應(yīng)的顏色深淺在一定圍與蛋白質(zhì)含量成正比。通過與已知含量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的生色結(jié)果進(jìn)行比較分析，即可檢測待測樣品的蛋白質(zhì)含量。目前實(shí)驗(yàn)室常規(guī)的快速定量測定蛋白質(zhì)含量方法中，以Lowry等人發(fā)展的Folin-酣法應(yīng)用最為普遍。該方法的優(yōu)點(diǎn)是:靈敏度高（比紫外吸收法靈敏度高10?20倍），操作簡單快速，不需復(fù)雜的儀器設(shè)備。1.2.2考馬斯亮藍(lán)法考馬斯亮藍(lán)G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由掠黑色變?yōu)樗{(lán)色。經(jīng)研究認(rèn)為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的械性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。在一定圍，考馬斯亮藍(lán)G250-蛋白質(zhì)復(fù)合物呈青色，在595nm下，吸光度與蛋白質(zhì)含量呈線性關(guān)系，故可以用于蛋白質(zhì)含量的測定。1.2.3紫外吸收法蛋白質(zhì)中普遍含有酪氨酸與色氨酸，由于這兩種芳香族氨基酸分子中含有大pi鍵，它們在280nm紫外光附近有光吸收，因而使蛋白質(zhì)在上述紫外光波長附近產(chǎn)生較強(qiáng)的光吸收，利用蛋白質(zhì)的這一特性可對其進(jìn)行含量測定。2.操作步驟2.1生物樣本中蛋白質(zhì)的提取1.用頸椎脫白法處死小鼠，切開腹腔，取下完整肝臟，小心去掉膽囊（不要弄破），放入盛冷生理鹽水的燒杯中漂洗干凈。2.取小鼠肝整個(gè)肝組織，在稱量紙上剪碎，放入玻璃勾裝管中。3.按1:15的比例往玻璃勾紫管中加入勾裝緩沖液（即每份樣品需加預(yù)冷的提取緩沖液6mL，蛋白酶抑制劑0.16mL)，手動勻漿。注意用力均勾，以免損壞勻漿管。4.勻漿完成后，取一支2mLeppendorf管，各加入1.8mL勾衆(zhòng)液后，置入冷凍離心中。5.5.于4℃,13000r/min離心20min后，小心取出上清液0.5ml至2mLeppendorf管中，加入0.5ml緩沖液，用于蛋白質(zhì)含量的測定，再取出上清液0.5ml至另一2mLeppendorf管中-20℃保存。2.2生物樣本中蛋白質(zhì)的測定2.2.1Lowry法1.取16mmxl50mm試管16支，標(biāo)號，放置在試管架上，在1?6號試管分別加入標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白（使用時(shí)取貯液用雙蒸水稀釋至0.5mg/ML）0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL，用雙蒸水補(bǔ)足至每管總體積0.5mL，在7、8號試管分別加入待測樣品25、50uL，并用雙蒸水補(bǔ)足至0.5mL(即將待測樣品稀釋20或10倍）。9?16管作為平行實(shí)驗(yàn)管重復(fù)1?8管的操作并同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，取算術(shù)平均值作為檢測結(jié)果。2.各管加入2.5mL新配制的堿性銅溶液，立即搖勻，在室溫下放置10min。3.各管加入0.5mLFolin–酚試劑應(yīng)用液，邊加入邊立即充分混合（用振蕩混合器），然后在室溫下放置30?60min(不要超過60min)。4.分別用1號和9號管作為空白對照調(diào)零，檢測其余標(biāo)準(zhǔn)樣品管及待測樣品管在550nm波長處的吸光度值。5.根據(jù)已知含量的標(biāo)準(zhǔn)樣品測得的吸光度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)待測樣品的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其蛋白質(zhì)含量。根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算出小鼠肝臟提取液的蛋白質(zhì)含量。2.2.2考馬斯亮藍(lán)法1.取16mmx150mm試管16支，標(biāo)號，放置在試管架上，在1?6號試管分別加入標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白（使用時(shí)取e液用雙蒸水稀釋至0.5mg/mL)0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mL，用雙蒸水補(bǔ)足至每管總體積0.1mL，在7.8號試管分別加入稀釋20、10倍的待測樣品0.1mL。9?16管作為平行實(shí)驗(yàn)管重復(fù)1?8管的操作并同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，取算術(shù)平均值作為檢測結(jié)果。2.每管加入考馬斯亮藍(lán)G—250染料試劑3mL，搖勾，室溫靜置3min3.分別用1號和9號管作為空白對照調(diào)零，檢測其余標(biāo)準(zhǔn)樣品管及待測樣品管在595nm處的吸光度值。4.根據(jù)已知含量的標(biāo)準(zhǔn)樣品測得的吸光度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)待測樣品的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其蛋白質(zhì)含量。根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算出小鼠肝臟提取液的蛋白質(zhì)含量。2.2.3紫外吸收法1.取16mmx150mm試管16支，標(biāo)號，放置在試管架上，在1?6號試管分別加入標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白（2mg/mL)0、0.3、0.45、0.6、0.75、0.9mL，用雙蒸水補(bǔ)足至每管總體積3mL，在7,8號試管分別加入稀釋100,50倍的待測樣品3mL。9?16管作為平行實(shí)驗(yàn)管重復(fù)1?8管的操作并同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，取算術(shù)平均值作為檢測結(jié)果。2.分別以1號管和9號管作為空白對照調(diào)零，用紫外分光光度計(jì)(注意用石英比色杯)于波長280nm處比色，記錄各管的吸光度值。3.根據(jù)已知含量的標(biāo)準(zhǔn)樣品測得的吸光度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)待測樣品的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其蛋白質(zhì)含量。根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算小鼠肝提取液的蛋白質(zhì)含量。3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1原始數(shù)據(jù)3.1.1Lowry法序號12345678牛血清蛋白濃度（mg/mL）00.10.20.30.40.5一號組吸光度值00.1820.3040.4000.4540.4840.3230.519二號組吸光度值00.1690.3030.3920.4430.4950.3420.517算術(shù)平均值00.17550.30350.3960.44850.48950.33250.5183.1.2考馬斯亮藍(lán)法序號12345678牛血清蛋白濃度（mg/mL）00.10.20.30.40.5一號組吸光度值00.1430.2620.3530.4190.5700.4090.739二號組吸光度值00.1550.2840.3670.5220.5790.4120.780算術(shù)平均值00.1490.2730.3600.47050.57450.41050.75953.1.3紫外吸收法序號12345678牛血清蛋白濃度（mg/mL）00.20.30.40.50.6一號組吸光度值00.0.0.2560.3240.3800.2290.405二號組吸光度值00.1160.0.2550.3160.3840.2000.408算術(shù)平均值00.12450.0.25550.3200.3820.21450.40653.2數(shù)據(jù)處理3.2.1Lowry法將y=0.3325代入擬合出的直線：y=0.95971x+0.06224中可得濃度為0.28mg/mL，原樣品中蛋白質(zhì)濃度為5.6mg/mL，則原來的濃度為11.2mg/mL。將y=0.518代入擬合出的直線：y=0.95971x+0.06224中可得濃度為0.48mg/mL，則原樣品中蛋白質(zhì)濃度為4.8mg/mL，則原來的濃度為9.6mg/mL。取平均值為10.4mg/mL。3.2.2考馬斯亮藍(lán)法將y=0.4105代入擬合出的直線：y=1.12114x+0.02421中可得濃度為0.34mg/mL，則樣品中蛋白質(zhì)濃度為6.8mg/mL，則原來的濃度為13.6mg/mL。將y=0.7595代入擬合出的直線：y=1.12114x+0.02421中可得濃度為0.66mg/mL，則樣品中蛋白質(zhì)濃度為6.6mg/mL，則原來的濃度為13.2mg/mL。取平均值為13.4mg/mL。3.2.3紫外吸收法將y=0.2145代入擬合出的直線：y=0.63886x+0.00021中可得濃度為0.34mg/mL，則樣品中蛋白質(zhì)濃度為6.8mg/mL，則原來的濃度為13.6mg/mL。將y=0.4065代入擬合出的直線：y=0.63886x+0.00021中可得濃度為0.64mg/mL，則樣品中蛋白質(zhì)濃度為6.4mg/mL，則原來的濃度為12.8mg/mL。取平均值為13.2mg/mL。4.討論：根據(jù)三種方法得出蛋白質(zhì)的濃度約為13.3mg/mL（沒有算第一種方法得出的結(jié)果，因?yàn)榉椒ㄒ恢械腞-square值只有0.9169），從后兩種方法的回歸線中可以看出還是很符合實(shí)驗(yàn)規(guī)律的。根據(jù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)歷和實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我更喜歡第二種方法。我們在選擇方法的時(shí)候主要考慮：①實(shí)驗(yàn)對測定所要求的靈敏度和精確度；②蛋白質(zhì)的性質(zhì)；③溶液中存在的干擾物質(zhì)；④測定所要花費(fèi)的時(shí)間。其中Lowry靈敏度高，不需要復(fù)雜儀器，但反應(yīng)需要的時(shí)間較長，操作的用時(shí)也有比較高的要求，同時(shí)容易受到非蛋白質(zhì)的影響，例如含有EDTA，甘氨酸等物質(zhì)的蛋白就不適合這種方法。之所以第一組數(shù)據(jù)尤其不準(zhǔn)，我想與我們組的操作水平不無關(guān)系，因?yàn)镕olin-酚試劑只有在酸性條件下穩(wěn)定，但還原反應(yīng)只在堿性條件下發(fā)生，所以加入的時(shí)候要立即混勻，可能這個(gè)沒有做好，另外就是實(shí)驗(yàn)室里分光光度計(jì)調(diào)整用了好久。再就是考馬斯亮藍(lán)法，靈敏度高，測定簡便，只要加一種試劑，而且染料的顏色可以在較長時(shí)間保持穩(wěn)定。我們組做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候是先一起做完Lowry法和考馬斯亮藍(lán)法之后去測定的，而調(diào)整分光光度計(jì)用時(shí)了很久，所以這種方法即時(shí)過了一段時(shí)間，測出來的數(shù)據(jù)也還很準(zhǔn)，不用像Lowry法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。并且該法干擾物質(zhì)很少，像K+,Na+，Mg+離子，EDTA等等的都不干擾。使用過考馬斯亮藍(lán)染液的比色杯比較難清洗，可以用乙醇脫色后再用清水清洗，注意少量多次。最后是紫外吸收法，相對于前兩種方法最大的優(yōu)勢就是速度很快，操作很簡單，也不需要消耗樣品，測定后能回收使用。如果要測定來源比較珍貴的，不容易獲取的蛋白質(zhì)濃度可以考慮這種方法。不過也有很多缺點(diǎn)，例如準(zhǔn)確度較差、如果樣品中有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會出現(xiàn)較大的干擾，同時(shí)敏感度也比較低，對蛋白的濃度要求較高。注意測試時(shí)必須