大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及重組子的轉化實驗報告

大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及重組子的轉化-實驗報告大腸桿菌，是一種伴隨我們終生的細菌，也是生物實驗常用的模式生物。通過感受態(tài)細胞的制備和宿主細胞的轉化等操作實現(xiàn)基因工程改造，大腸桿菌便成為基因工程菌，并造福人類。本期科創(chuàng)科普就讓我們一起來了解相關的實驗操作及原理吧！10000X大腸桿菌電鏡圖Part01大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備如果我們直接將外源DNA和宿主細胞放在一起，由于細胞膜具有選擇透性，外源DNA無法穿過細胞膜進入宿主細胞。因此我們需要制備感受態(tài)細胞，改變細胞膜結構，增加其通透性，然后才可以進行外源DNA的導入。在本次介紹中，我們采用最常見的CaCl2法進行感受態(tài)細胞的制備。大腸桿菌感受態(tài)細胞圖[1]CaCl2法的優(yōu)缺點及原理優(yōu)點：操作簡單,重復性好。缺點：影響因素較多,若不注意細節(jié)和條件實驗容易失敗。[2]Ca2+改變細胞膜通透性的原理：非生理條件的Ca2+濃度下，一方面，高濃度的Ca2+聚集在細胞表面改變細胞壁的滲透性，使外源DNA更易接近細胞膜；另一方面，少量Ca2+進入細胞，可在細胞膜上形成新的通道，為外源DNA進入細胞提供條件。[3]實驗步驟大腸桿菌感受態(tài)細胞制備實驗步驟圖這個實驗看起來簡單重復；其實不然，感受態(tài)細胞的制備有很多影響因素，哪怕只是濃度的些許差別，都可能使轉化效率下降幾個數(shù)量級。影響大腸桿菌感受態(tài)細胞制備的因素Ca2+終濃度：Ca2+終濃度是維持細胞膜通透性的關鍵因素。當Ca2+濃度在100mmol·L-1時，質粒的轉化率最高，而大腸桿菌攝取DNA的能力不受轉化前是否經過Ca2+處理的影響。[2]數(shù)據(jù)來源[4]CaCl2的滅菌方式：不可采用高溫滅菌法，高溫滅菌法并不能有效除去雜質，反而會使溶劑減少，形成沉淀物，影響溶液的pH值；應采用過濾滅菌法，可避免上述缺點。[1]大腸桿菌的生長狀態(tài)：其理想狀態(tài)是處于對數(shù)生長早期，生長過度或者發(fā)育不全的細菌制備感受態(tài)細胞的轉化率都較低。[2]離心速度和時間：經過CaCl2處理后的大腸桿菌處于膨脹狀態(tài)，過快過久的離心會損傷細胞。[2]More：除了CaCl2法，還有TSS法、甘油-聚乙二醇法、電轉化技術、超聲波轉化，前兩種為化學法，后兩種為物理法。感興趣的同學可以自行了解。Part02受體細胞的轉化感受態(tài)細胞制備完成后，接下來是質粒的導入和相應性狀的表達。EGFP（綠色熒光蛋白）的介紹明明有這么多熒光蛋白，為什么我們選擇GFP呢？綠色熒光蛋白于1962年被日本科學家下村修發(fā)現(xiàn)并分離，是最早被發(fā)現(xiàn)的熒光蛋白，因此它是最為我們所熟悉的一種熒光蛋白。當然，GFP的優(yōu)點不止這一個，現(xiàn)在有了加強版EGFP，讓其熒光更加明顯。而其他的熒光蛋白會有光譜重疊，普通的熒光顯微鏡不易看清。所以我們選擇使用EGFP。實驗步驟以及現(xiàn)象的觀察五步教你輕輕松松導入質粒冰浴→熱激→冰浴→復蘇→涂布培養(yǎng)Q1：為什么采用冷熱交替的方式？A1：細菌處于0℃，CaCl2的低滲溶液中，大腸桿菌會膨脹成球形，轉化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基-鈣磷酸復合物粘附于細胞表面（因為DNase會消化外源DNA，所以形成抗DNase的物質有利外源DNA的生存），從低溫突然提高到42℃短時間熱刺激，應激反應下可產生大量可改變細胞膜通透性的cAMP，促使細胞吸收外源DNA，從而大大提高轉化率。Q2：如何看到綠色熒光？A2：取大腸桿菌培養(yǎng)液，離心，棄上清液，無菌水洗滌后置于載玻片上，可用熒光顯微鏡在紫外光下進行鏡檢。[5]當然，在紫外光下，表達了綠色熒光蛋白的單菌落也會發(fā)出肉眼可見的綠色熒光。熒光顯微鏡下大腸桿菌細胞團[6]紫外光下大腸桿菌單菌落大腸桿菌的轉化實驗是一個經典的標準實驗，通過本期科創(chuàng)科普，相信大家都對感受態(tài)細胞的制備和受體細胞的轉化實驗有了一定了解。本期的科創(chuàng)科普就到這里啦，我們下期再見。參考文獻：[1]謝志雄,陳向東,李文化,沈萍,龐代文.大腸桿菌HB101感受態(tài)細胞的嫌我觀察與分析.武漢大學學報(理學版),2002,(02),253-256+132[2]郭夢桃,吳靖芳.大腸桿菌感受態(tài)細胞制備及轉化研究現(xiàn)狀.河北北方學院學報(自然科學版),2020,36(08),44-48[3]李文化.Ca2+誘導對大腸桿菌攝取外源DNA的研究.[D].武漢,武漢大學生命科學學院.2004,04[4]梅運軍,陳向東,謝志雄,沈萍,李文化.Ca2+對誘導大腸桿菌攝取外源DNA的影響武漢大學學報(理學版),2012,58(04),354-358DOI:10.14188/j.1671-8836.2012.04.018[5]趙仲麟,袁超,朱偉,蘇同福,潘振良,金顯春.化學生物學綜合創(chuàng)新設計實驗——大腸桿菌中表達綠色熒光蛋白.江西農業(yè)學報,2011,23(08),167-168+171DOI:10.193