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雙熒光素酶報告基因檢測(二)雙熒光素酶實驗通常被用來評估m(xù)iRNA是否與其潛在的靶基因發(fā)生相互作用。實驗中,預(yù)測的miRNA靶標(biāo)基因的3’-UTR序列被克隆到含有螢火蟲熒光素酶的報告基因載體的3’-UTR位置。如果miRNA與插入到質(zhì)粒中的目標(biāo)序列發(fā)生結(jié)合,miRNA將通過抑制該序列的翻譯來降低螢火蟲熒光素酶的表達(dá),進而導(dǎo)致熒光強度的下降。這一變化可以作為miRNA與靶基因結(jié)合的指標(biāo)。miRNA簡介microRNA(miRNA)是一類長度在22nt左右的小RNA分子,它并不編碼蛋白質(zhì),因此miRNA與siRNA和circRNA等小RNA分子一樣,也是一種非編碼RNA。通過參與調(diào)節(jié)其下游基因翻譯過程面發(fā)揮其生物學(xué)功能。miRNA的功能機制與siRNA相似,主要通過與靶RNA的堿基形成互補配對,從而導(dǎo)致RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)介導(dǎo)的RNA降解或阻止mRNA被翻譯成蛋白。區(qū)別在于,miRNA通常與mRNA的3'UTR區(qū)域發(fā)生結(jié)合。miRNA與靶基因的作用機制通過將miRNA靶基因的結(jié)合位點構(gòu)建到熒光素酶報告載體系統(tǒng)里,同時和miRNA寡核苷酸轉(zhuǎn)染,觀察熒光的強度變化,來判斷miRNA是否作用了靶基因。miRNA的基本作用機制有兩種:1.抑制蛋白翻譯miRNA能以4種不同的方式抑制蛋白質(zhì)表達(dá):(1)使正在翻譯的蛋白發(fā)生降解;(2)抑制翻譯延伸;(3)使翻譯過早終止(使核糖體從RNA上提早掉下來,沒法行使翻譯功能);(4)抑制翻譯起始。2.通過不完全的miRNA-mRNA互補配對誘導(dǎo)靶RNA降解。由于miRNA的作用機制是比較復(fù)雜的,所以我們在檢測miRNA作用的時候,不光要檢測一下它的靶基因的RNA水平的表達(dá),還要檢測一下靶基因的蛋白表達(dá)。圖1載體構(gòu)造與miRNA與靶基因的作用機制(DOI:10.3892/or.2018.6944)miRNA與靶基因的作用實驗步驟通過實驗原理我們知道對于miRNA靶基因驗證實驗我們需要構(gòu)建的轉(zhuǎn)染工具有:(1)對于miRNA有miRNA對照組(miRNA-NC)和miRNA過表達(dá)(miRNA);(2)對于靶基因的3’UTR有3’UTR空載對照組(3’UTR-NC),3’UTR野生型(3’UTR-WT),3’UTR突變型(3’UTR-Mut)。一般是按照如下分為六組(已用序號標(biāo)明)。1.microRNA靶點的預(yù)測利用Targetscan,miRDB,PicTar軟件預(yù)測靶基因3’UTR與microRNA的結(jié)合位點。2.構(gòu)建含靶基因3’UTR的雙熒光素酶報告基因載體根據(jù)軟件預(yù)測的靶基因3’UTR與microRNA的結(jié)合位點,設(shè)計引物PCR擴增靶基因3’UTR序列,或直接進行基因合成,再插入到雙熒光素酶報告基因載體上。3.microRNAmimics和microRNAnegativecontrol的合成合成相應(yīng)的microRNAmimics和microRNAnegativecontrol.4.細(xì)胞轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備將靶基因3’UTR的雙熒光素酶報告基因載體和microRNAmimics或microRNAnegativecontrol共轉(zhuǎn)染293T或Hela細(xì)胞。5.熒光素酶檢測共轉(zhuǎn)染細(xì)胞24-72h后,進行雙熒光素酶檢測,確定目的microRNA的靶基因??返律铮↘MDBioscience)(/)建立了完善的細(xì)胞培養(yǎng)平臺,能夠提供給客戶多種細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)實驗,可以提供優(yōu)質(zhì)的免疫檢測服務(wù)—雙熒光素酶標(biāo)記基因檢測。我們從以下案例來分析:案例我們以MicroRNA-1269binhibitsgastriccancerdevelopmentthroughregulatingmethyltransferase-like3(METTL3)來分析。MicroRNA(miRNA)表達(dá)失調(diào)與許多腫瘤的進展有關(guān),據(jù)報道,miR-1269b的異常表達(dá)在某些癌癥的進展中起著關(guān)鍵作用,研究旨在研究miR-1269b在胃癌(GC)進展中的作用及其隱藏機制。METTL3是GC細(xì)胞中miR-1269b的下游靶標(biāo),通過StarBase在線分析數(shù)據(jù)庫(/),發(fā)現(xiàn)miR-1269b和METTL3mRNA3-UTR之間存在結(jié)合位點(圖3A)雙熒光素酶報告分析強調(diào)miR-1269b過表達(dá)可以降低293T細(xì)胞中METTL3-WT的螢光素酶活性,但METTL3-MUT的表達(dá)沒有受到顯著影響,qRT-PCR和Western印跡表明,與對照(miR-NC或miR-in)相比,miR-1269b過表達(dá)顯著降低了NCI-N87細(xì)胞中METTL3mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá),而miR-1269b抑制劑轉(zhuǎn)染SNU-16細(xì)胞的作用相反(圖3C和D)。通過qRT-PCR,我們還發(fā)現(xiàn)METTL3在GC組織中的表達(dá)明顯高于鄰近組織(圖3E)。相關(guān)性分析強調(diào),miR-1269b的表達(dá)與GC組織中METTL3mRNA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(圖3F)。上述結(jié)果表明,miR1269b可以靶向METTL3mRNA3-UTR,并負(fù)調(diào)控GC細(xì)胞中METTL3的表達(dá)。Fig.1METTL3isthetargetofmiR-1269bA)ThepredictedbindingsequencebetweenMETTL3mRNA3UTRandmiR-1269b.(b)Dual-luciferasereportergeneassaywasusedtoverifythebindingrelationshipbetweenMETLL3mRNA3UTRandmiR-1269b.(c)and(d)qRT-PCRandWesternblotwereusedtodetecttheexpressionofMETTL3mRNAandproteininNCI-N87andSNU-16cellstransfectedwithmiR-1269bmimicsorinhibitors.(e)qRT-PCRwasusedtodetecttheexpressionofMETTL3mRNAinGCtissuesandadjacenttissues.(f)PearsoncorrelationwasusedtoanalyzethecorrelationbetweenMETTL3mRNAexpressionandmiR-1269bexpressioninGCtissues.**P<0.01,and***P<0.0這張圖片主要內(nèi)容為驗證miR-1269b和靶基因METTL3互作。圖a:StarBase進行生物信息學(xué)分析靶基因的3’-UTR區(qū)序列是否有miRNA結(jié)合位點;圖b:雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?;圖c和d:qRT-PCR和WB檢測miR-1269b對靶基因METTL3mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響;圖f:相關(guān)性分析miRNA-1269b和靶基因METTL3之間的關(guān)系。接著,我們又對以下的文獻(xiàn)進行分析,Hepatocyte-specificsuppressionofmicroRNA-221-3pmitigatesliverfibrosis,主要為miR-221-3p結(jié)合Gnai基因3’UTR區(qū)調(diào)節(jié)HSCs細(xì)胞活化影響肝纖維化。miR-221-3p通過GNAI2抑制了HSCs的激活,慢性肝損傷期間,阻斷肝細(xì)胞中的miRNA-221-3p功能有助于肝臟的恢復(fù)和更快地解決細(xì)胞外基質(zhì)的沉積問題。此外,作者證明,miRNA-221-3p對GNAI2具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用,導(dǎo)致C–Cmotif趨化因子配體2的分泌減少,從而減輕了肝纖維化。miRNA-221-3p的抑制可作為治療肝纖維化的治療方法之一。通過生物信息學(xué)分析以及相關(guān)軟件預(yù)測,獲得miR-221-3p可能的靶向基因Gnai2(A)。WB和qPCR結(jié)果顯示,與健康組相比GNAI2的表達(dá)水平較低(B),與Control相比,AAVTud組GNAI2表達(dá)水平提高(C,D),這可能與miR-221-3p的上調(diào)有關(guān)。之后用miR-221-3pmimics處理正常肝細(xì)胞,結(jié)果顯示,與陰性對照組相比,miR-221-3pmimics處理組的GNAI2表達(dá)水平顯著降低(E)。雙熒光素酶實驗結(jié)果進一步證明了miR-221-3pmimics直接靶向Gnai2的3’UTR。綜上,作者證明miR-221-3p直接參與Gnai2的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。Fig.1Gnai2isanoveltargetgeneofmiR-221-3p.(A)A30UTRsequenceofGnai2targetedbymiR-221-3p.(B)GNAI2issignificantlydownregulatedinprimaryhepatocytesisolatedfromfibroticlivertissuesinvivo.AAVTuDinjectionleadstoupregulationofGnai2(C)mRNAand(D)proteinlevelsinisolatedprimaryhepatocytes(n=7mice/group).(E)TransfectionofmiR-221-3pmimicinprimaryhepatocytesleadstoadecreaseinGNAI2proteinlevelscomparedwithrespectivescramblecontrol(n=5).(F)DualluciferasereporterassayshowsthatmiR-221-3pdirectlybindsto30UTRofGnai2,suggestingthatGnai2isadirecttargetofmiR-221-3p.Dataareshownasfoldchangeandcomparedwiththecontrolgroupsetas1.Errorbarsrepresent±SEM.One-wayANOVAwasusedforstatistic
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