DB5132T 88-2023牦牛肉PCR-膜芯片技術(shù)檢驗方法

ICS07.080A04DB5132四川?。ò尾刈迩甲遄灾沃荩┑胤綐?biāo)準(zhǔn)DB5132/T88—2023牦牛肉PCR—膜芯片技術(shù)檢驗方法IdentificationofYakMeatwithPCR-membraneChipTechnology2023-10-26發(fā)布2023-12-25實施阿壩藏族羌族自治州市場監(jiān)督管理局發(fā)布IDB5132/T88—2023前言 II引言 III 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義、縮略語 13.1術(shù)語和定義 1 1 25設(shè)備與材料 26主要試劑 27實驗用水 28檢驗步驟 2 2 38.3多重PCR反應(yīng)體系 48.4膜芯片制備 48.5雜交顯色 48.6結(jié)果判讀 59結(jié)果表述 510生物安全及檢測過程中防止交叉污染的措施 5參考文獻 7IIDB5132/T88—2023本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》給出的規(guī)則起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由阿壩藏族羌族自治州農(nóng)業(yè)農(nóng)村局提出并歸口。本文件起草單位：四川省龍日種畜場、西南民族大學(xué)、成都產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院有限責(zé)任公司、成都鴻宜瑞信息技術(shù)咨詢有限公司。本文件主要起草人：何明珠、江明鋒、史贇學(xué)、趙睿驍、蒲華榮。IIIDB5132/T88—2023本文件的發(fā)布機構(gòu)提請注意,聲明符合本文件時，可能涉及到專利號為ZL201910400450.2《一種牦牛肉鑒定試劑盒》相關(guān)的專利的使用。本文件的發(fā)布機構(gòu)對于該專利的真實性、有效性和范圍無任何立場。該專利持有人已向本文件的發(fā)布機構(gòu)承諾。他愿意同任何申請人在合理且無歧視的條款和條件下，就專利授權(quán)許可進行談判。該專利持有人的聲明已在本文件的發(fā)布機構(gòu)備案。相關(guān)信息可以通過以下聯(lián)系方式獲得:專利持有人姓名:江明鋒(西南民族大學(xué)),文勇立(西南民族大學(xué)),王譽(西南民族大學(xué))。請注意：除上述專利外，本文件的某些內(nèi)容仍可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。1DB5132/T88—2023牦牛肉PCR-膜芯片技術(shù)檢驗方法1范圍本文件規(guī)定了牦牛肉動物源性成分的PCR-膜芯片技術(shù)檢測方法。本文件適用于水牛、黃牛、豬、羊、雞、兔、鴨、狗、牦牛肉及其制品的動物源性成分檢測，檢出2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T27403實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測GB/T34796水溶液中核酸的濃度和純度檢測3術(shù)語和定義、縮略語3.1術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1.1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)polymerasechainreaction；PCR在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為伸起點，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程。3.1.2多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)multiplexPCR在同一PCR反應(yīng)體系中加入兩對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應(yīng)。3.1.3膜芯片技術(shù)membraneChipTechnology將預(yù)先制備的DNA探針有序的固定于尼龍膜表面，然后與標(biāo)記的樣品雜交，通過對雜交信號的檢測分析，得出樣品的遺傳信息（基因序列及表達(dá)的信息）。3.2縮略語2DB5132/T88—2023SSPE：核酸雜交緩沖液4原理針對牦牛肉及市場常見假冒牦牛肉動物源性成分特異基因片段設(shè)計引物，對DNA模板進行多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增，擴增產(chǎn)物與固定有目標(biāo)基因特異性探針的膜芯片進行雜交，經(jīng)化學(xué)顯色后可在雜交點上形成肉眼可見的雜交信號。5設(shè)備與材料除實驗室滅菌及常規(guī)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：5.4生物安全柜5.5膜芯片雜交儀（MFS-8)5.6尼龍轉(zhuǎn)印膜（厚度6mm孔徑0.45μm負(fù)電荷）6主要試劑6.1動物組織基因組DNA提取試劑盒。6.4去活化清洗液（2×SSPE，0.1%SDS）。6.6孵育液（堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉親和素按1∶2000的比例加入孵育液中）。6.9顯色液（BCIP/NBT、5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和氯化硝基四氮唑蘭）。6.10PCR引物及探針（引物濃度20μmol/L、探針濃度5μmol/L）。7實驗用水實驗用水符合GB/T6682-2008《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》中一級水的要求。8檢驗步驟3DB5132/T88—20238.1PCR引物及探針引物和探針序列見表1。表1PCR引物信息豬鴨狗兔雞4DB5132/T88—20238.2樣品處理與DNA提取抽取牦牛鮮肉（牦牛肉制品）經(jīng)制備后，使用動物組織基因組DNA提取試劑盒提取并純化DNA。8.2.1DNA濃度按GB/T34796《水溶液中核酸的濃度和純度檢測》規(guī)定的方法進行，DNA的濃度≥10%。8.3多重PCR反應(yīng)體系以8.2中提取并純化后的DNA為模板，在20μL體系中加入Mix酶10μL、正向引物（20μ8.4膜芯片制備將尼龍轉(zhuǎn)印膜制備成1.2cm×1.815×SSC浸泡15min，取出放在濾紙上60℃烘干，待尼龍膜降溫至室溫，按順序加入內(nèi)參探針（5μ圖1芯片點樣模式圖8.5雜交顯色2)將PCR變形產(chǎn)物加入膜芯片雜交儀中,并開始雜交程序。3)膜芯片去活化：將制備好的膜芯片放入雜交盒內(nèi)，芯片標(biāo)簽正面朝上，加入1mL去活5DB5132/T88—20237)孵育：吸除雜交清洗液，加入預(yù)熱好的酶孵育液，42℃水平搖床90r/min，震蕩孵育30去離子水37℃洗滌2次，待膜芯片干燥后進行結(jié)果判讀。具體流程如表2所示。表2雜交流程表85555555558.6結(jié)果判讀表3膜芯片結(jié)果判定結(jié)果類型內(nèi)參基因靶基因結(jié)果判定1 雜交失敗，重復(fù)試驗2-+--PCR擴增失敗，重復(fù)試驗3++--樣品中不含本標(biāo)準(zhǔn)中9中動物源性成分4++-+樣品中含有與陽性信號點對應(yīng)的動物源性成分注：“+”為陽性，“-”為陰性。9結(jié)果表述9.1牦牛點顯色，表述為“檢出牦牛成分”；牦牛點未顯色，表述為“未檢出牦牛成分”。9.2牦牛點與其他靶基因點同時顯色，表述為“檢出牦牛成分，且混有顯色點動物源性成分”。6DB5132/T88—202310生物安全及檢測過程中防止