第十三章  平面色譜法

分析化學——藥用化學基礎第十三章??平面色譜法

薄層色譜法平面色譜法概述01020304目錄

紙色譜法實訓十五酚酞片中熒光母素的檢查目前，色譜法在醫(yī)學檢驗、衛(wèi)生監(jiān)測、食品及藥品檢驗等領域的重要分析手段，具有靈敏度高、選擇性高、分離效能高、分析速度快及應用范圍廣等優(yōu)點。在《中國藥典》（2020版）里，中藥材及其制劑的鑒別中，多數(shù)都應用了薄層色譜法，比如人參、牛黃、丁香等。學習導學§13-1

平面色譜法概述學習目標1.掌握色譜法的基本原理2.熟悉色譜法的分類3.了解色譜法的特點一、原理1.原理

主要是利用樣品中的各組分在流動相與固定相之間的分配系數(shù)差異而實現(xiàn)分離。通過兩相的相對運動，使物質在兩相中進行多次反復分配，分配系數(shù)大的物質（組分）遷移速度慢，反之則遷移速度快，從而被分離。組分固定相流動相圖13-1吸附柱色譜法的色譜過程示意圖一、原理2.

分配系數(shù)K是指在一定溫度和壓力下，某組分在兩相間的分配達到平衡時的濃度（或溶解度之比），即：二、分類

流動相是氣體。當固定相是固體時，稱為氣-固色譜；固定相是液體時，稱為氣-液色譜。液相色譜法液相色譜法按兩相物理狀態(tài)分類

流動相是液體。當固定相是固體時，稱為液-固色譜；固定相是液體時，稱為液-液色譜。二、分類

按分離原理分類離子交換色譜法吸附色譜法利用不同組分對固定相表面吸附中心吸附能力的差別而實現(xiàn)分離目的的方法。

利用不同組分在固定相和流動相中的溶解度的差別而實現(xiàn)分離目的的方法。分配色譜法

利用不同組分因分子大小不同受到固定相的阻滯差別而實現(xiàn)分離目的的方法。分子排阻色譜法(也稱為空間排阻色譜法)利用不同組分離子交換能力的差別而實現(xiàn)分離目的的方法。二、分類紙色譜法(PC)柱色譜法(CC)將固定相裝在色譜柱內(nèi)，流動相攜帶樣品自上而下移動使不同組分分離的方法。

將固定相均勻地涂布于玻璃板上形成厚薄均勻的薄層，點樣后用流動相展開使不同組分分離的方法。薄層色譜法(TLC)以色譜濾紙為載體，濾紙纖維上吸附的水為固定相，點樣后用流動相展開使不同組分分離的方法。按操作形式分類(1)靈敏度高(2)選擇性高(3)分離效能高(4)分析速度快(5)應用范圍廣三、特點§13-2薄層色譜法學習目標1.掌握薄層色譜法的原理、操作方法和定性、定量的應用。2.了解薄層色譜法的吸附劑和展開劑，以及薄層色譜法的應用。1.概念：將固定相（如吸附劑）均勻地涂鋪在具有光潔表面的玻璃、塑料或金屬板上，形成0.25～1mm厚的薄層，在此薄層上進行色譜分離的方法稱為薄層色譜法。一、原理2.比移值Rf：一、原理圖13-2Rf值的測量示意圖2.比移值Rf：根據(jù)Rf值的定義，其值在0～1之間變化。分配系數(shù)越小，Rf值越大。組分之間的分配系數(shù)相差越大，則各組分的Rf值相差也越大，表示越易分離。一、原理3.影響比移值Rf的因素：展開劑的組成展開時的溫度展開劑蒸氣的飽和程度薄層的性能一、原理二、儀器與材料１.薄層板按支持物的材質分為玻璃板、塑料板或鋁板等。按固定相種類分為硅膠薄層板、鍵合硅膠板、微晶纖維素薄層板、聚酰胺薄層板、氧化鋁薄層板等。按固定相粒徑大小分為普通薄層板（10～40μm）和高效薄層板（5～10μm）。二、儀器與材料2.點樣器

一般采用微升毛細管或手動、半自動、全自動點樣器材。二、儀器與材料3.展開容器

上行展開一般可用適合薄層板大小的專用平底或雙槽展開缸，展開時須能密閉。水平展開用專用的水平展開槽。二、儀器與材料4.顯色裝置噴霧顯色應使用玻璃噴霧瓶或專用噴霧器，要求用壓縮氣體使顯色劑呈均勻細霧狀噴出；浸漬顯色可用專用玻璃器械或用適宜的展開缸代用；蒸氣熏蒸顯色可用雙槽展開缸或適宜大小的干燥器代替。二、儀器與材料5.檢視裝置為裝有可見光、254nm及365nm紫外光光源及相應的濾光片的暗箱，可附加攝像設備供拍攝圖像用。暗箱內(nèi)光源應有足夠的光照度。二、儀器與材料6.薄層色譜掃描儀系指用一定波長的光對薄層板上有吸收的斑點，或經(jīng)激發(fā)后能發(fā)射出熒光的斑點，進行掃描，將掃描得到的譜圖和積分數(shù)據(jù)用于物質定性或定量的分析儀器。三、操作方法1.薄層板的制備干法鋪板操作簡單，只適用于氧化鋁和硅膠。鋪成的軟板不堅固、易松散，展開時只能近水平展開，顯色時易吹散，操作時應非常小心、細致。軟板一般用于摸索色譜展開的條件。三、操作方法1.薄層板的制備濕法鋪板傾注法制板平鋪法制板機械涂鋪法制板三、操作方法2.點樣在薄層板的一端1.5?2cm處點樣；內(nèi)徑為0.5mm的平頭毛細管或微量注射器點樣；點樣斑點直徑不宜超過2?3mm，斑點之間的間距為2cm；若樣品溶液濃度太稀，可反復點幾次；為了避免在空氣中吸濕而降低活性，一般點樣時間不超過10min為宜；點樣后待溶劑揮發(fā)，即可放入色譜缸內(nèi)展開。三、操作方法3.展開展開劑不與被測組分發(fā)生化學反應；Rf值要求在0.3~0.8之間，Rf值之間應相差0.05以上；易于獲得邊緣整齊的圓形斑點；盡可能不用高沸點溶劑做展開劑，便于干燥。三、操作方法4.顯色紫外燈顯色顯色劑噴灑壓板法側吮法四、操作條件1.吸附劑的選擇吸附指溶質在液-固兩相的交界面上集中濃縮的現(xiàn)象。吸附劑一般為多孔性微粒狀物質，其表面有許多吸附中心，當組分分子占據(jù)吸附中心時，即被吸附，當流動相(洗脫劑)分子從吸附中心置換出被吸附的組分分子時,即為解吸。四、操作條件1.吸附劑的選擇類型

氧化鋁氧化鋁G、氧化鋁H、氧化鋁HF254硅膠硅膠H、硅膠G、硅膠HF254四、操作條件2.展開劑的選擇分離中各斑點的Rf值要求在0.3~0.8之間，Rf值之間應相差0.05以上；如果做堿性物質分離時，在展開劑中可適當加入堿性溶劑，如氨水或吡啶等；如分離酸性物質時，可在展開劑中適當加入酸性溶劑如乙酸、甲酸等。五、定性和定量1.定性薄層色譜定性分析的依據(jù)是：在固定的色譜條件下，相同物質的Rf值相同。五、定性和定量1.定性定性方法：已知物對照法相對比移值法五、定性和定量2.定量目視定量法洗脫定量法薄層掃描儀定量六、應用和實例優(yōu)點設備簡單操作方便展開迅速顯色容易能用腐蝕性顯色劑常用于有機物的分離和鑒定藥物分析衛(wèi)生監(jiān)測環(huán)境保護氨基酸及其衍生物的分析§13-3紙色譜法學習目標1.掌握紙色譜法的原理。2.了解紙色譜的操作方法和應用。1.概念：紙色譜法是以濾紙作為載體的色譜法，按分離原理屬于分配色譜法的范疇。固定相一般為濾紙纖維上吸附的水，流動相為不與水混溶的有機溶劑。一、原理二、儀器與材料１.展開容器通常為圓形或長方形玻璃缸；缸上具有磨口玻璃蓋；應能密閉。二、儀器與材料2.點樣器

常用點樣器：具有支架的微量注射器（平口）或定量毛細管（無毛刺）；點樣位置正確、集中。二、儀器與材料3.色譜濾紙

質地均勻平整，具有一定機械強度，不含影響展開效果的雜質；不應與所用顯色劑起作用，以免影響分離和鑒別效果，必要時可進行處理后再用。三、操作方法1.點樣在距紙的一端2~3cm處點樣；用內(nèi)徑為0.5mm均勻的玻璃毛細管或微量注射器吸取樣品溶液；將1~2μl的樣品溶液均勻地點在已做好標記的起始線上,點樣斑點直徑不宜大于2~3mm，樣點之間的間距為2cm；若樣品濃度較稀，可反復點幾次，每點一次須用電吹風吹干后再點第二次；點樣量不宜過多，否則易造成拖尾。三、操作方法2.展開化合物類別展開溶劑顯色劑有機酸正丁醇:醋酸:水4：1：5正丁醇:乙醇:水4：1：5漠甲酚綠(溶解0.04g漠甲酚綠于100ml乙醇中，加O.Olmol/LNaOH直到剛出現(xiàn)藍色為止)顯黃色斑點酚類正丁醇:醋酸:水4：1：5正丁醇:毗嚏:水2：1：5三氯化鐵(溶解2g三氯化鐵于100ml0.5mol/LHC1中)顯藍色或綠色斑點糖類正丁醇:乙醇:水4：1：5正丁醇:醋酸:水4：1：5鄰苯二甲酸苯胺(0.93g苯胺、1.66g鄰苯二甲酸溶于100ml水飽和的正丁醇中)105℃加熱，呈紅色或棕色斑點氨基酸正丁醇:醋酸:乙醇:水4：1：1：2戊醇:毗嚏:水35：35：30水飽和的酚茚三酮(0.3g茚三酮溶于100ml醋酸)80℃加熱，呈紅色斑點常用的展開劑和顯色劑三、操作方法2.展開上行展開法下行展開法雙向展開法輻射水平展開法三、操作方法3.顯色展開完畢后，取出濾紙，在展開劑到達的前沿用鉛筆輕輕劃一記號，在室內(nèi)晾干，即可觀察到色斑，然后在紫外燈下觀察熒光斑點，標出位置、大小，并記錄顏色及強度。如某些組分既不顯色斑，又不顯熒光，則可根據(jù)組分的特性反應，噴灑合適的顯色劑，使色譜斑點顯色。需要加熱后才能顯色的則可用烘箱或電吹風加熱。四、色譜濾紙的選擇與處理濾紙的要求質地均勻、純凈、平整無折痕，邊緣整齊，以保證溶劑展開速度均勻；紙質的松緊和厚度適宜;應有一定的機械強度，不易斷裂。四、色譜濾紙的選擇與處理濾紙的選擇當幾種組分的Rf值相差很小時，宜采用慢速濾紙；若幾種組分的Rf值相差較大時，則可采用中速濾紙或快速濾紙；需考慮展開劑的性質；定性鑒別選用薄濾紙，制備定量應選用厚濾紙。四、色譜濾紙的選擇與處理濾紙的預處理為了適應某些特殊需要，可將濾紙進行預處理，使具有新性能。

例如：將濾紙浸入一定pH值的緩沖溶液中處理后，使濾紙維持恒定的酸堿度，用于分離酸、堿性物質。用甲酰胺、二甲基甲酰胺等代替水作固定相，以增加物質在固定相中的溶解度，用于分離一些極性較小的物質，降低Rf值，改善分離效果。五、定性和定量1.定性經(jīng)過顯色反應可粗略知道樣品屬于哪一類物質:如樣品噴灑茚三酮后顯色，知樣品中含有氨基酸。噴灑三氯化鐵顯色，則樣品含有酚類物質等。具體要知道每個色斑是哪一種物質，則需測量色斑的Rf值與已知物質的Rf值比較(或參閱文獻資料),或測量色斑的Rf值后才可確定。五、定性和定量2.定量目測法剪洗法光密度測定法六、應用和實例優(yōu)點儀器簡單操作方便所需樣品量少樣品分離后各組分的定性、定量都比較方便廣泛應用于混合物的分離、鑒定、微量雜質的檢查對中草藥成分的研究;衛(wèi)生檢驗毒物測定;生化檢驗中氨基酸、蛋白質、酶等的分離鑒別等。實訓十五酚酞片中熒光母素的檢查一、實訓目的1.薄層色譜法的操作二、器材準備１.器材薄層板、毛細管、展開缸、紫外燈２.試劑與試藥熒光母素對照品、無水乙醇、環(huán)己烷、二甲苯、濃硫酸三、實訓內(nèi)容與步驟1.熒光母素取本品的細粉適量（約相當于酚酞0.1g），加無水乙醇溶解并稀釋制成每1ml中含20mg的溶液，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。2.另取熒光母素對照品適量，用無水乙醇制成每1ml中含0.10mg的溶液，作為對照品溶液。三、實訓內(nèi)容與步驟3.吸取供試品溶液與對照品溶液各5μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以無水乙醇-環(huán)己烷-二甲苯（1：1：4）為展開劑，展開，晾干，噴以硫酸-無水乙醇（1：1），在105℃加熱5～10分鐘，置紫外光燈（365nm）下檢視。4.供試品溶液如顯與對照品溶液對應的雜質斑點，其熒光強度與對照品溶液的主斑點比較，不得更強（0.5%）。三、實訓內(nèi)容與步驟5.完成酚