不同氮源對蘋果白術(shù)發(fā)酵過程的影響

不同氮源對蘋果白術(shù)發(fā)酵過程的影響

蘋果是由飲酒和提取的新果酒精蒸餾而成的。酵母菌在蘋果白蘭地發(fā)酵過程中起著至關(guān)重要的作用,其發(fā)酵力的好壞,副產(chǎn)物的多少,不僅直接影響產(chǎn)量的高低,而且間接影響產(chǎn)品風味。目前在發(fā)酵過程中發(fā)酵緩慢甚至停滯現(xiàn)象仍然是很普遍的問題。因此尋找解決蘋果白蘭地發(fā)酵中糖的利用率和糖酒轉(zhuǎn)化率的方法是亟待解決的問題。氮源是酵母生長所必需的營養(yǎng)物質(zhì)之一,蘋果汁中含有足夠酵母生長所必須的碳水化合物,但氮源含量較低,不足以滿足釀酒酵母在發(fā)酵過程中的生長,從而會導致發(fā)酵酒精度低殘?zhí)橇扛叩默F(xiàn)象。因此在發(fā)酵中添加適宜的氮源,將會有利于酵母的生長及提高蘋果白蘭地的產(chǎn)量和質(zhì)量,降低成本,提高經(jīng)濟效益。本工作以氯化銨、蛋白胨、磷酸氫二銨、L-精氨酸為研究對象,研究氮源種類及濃度對蘋果白蘭地酒精發(fā)酵的影響,以期為蘋果白蘭地發(fā)酵提供一種新方法,為氮源在發(fā)酵中的應用提供理論依據(jù)和實踐指導。1材料和方法1.1材料和分析方法釀酒酵母1023和1620由中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)提供;斜面培養(yǎng)基采用PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯20%,葡萄糖2%,瓊脂2%,pH自然);種子培養(yǎng)基采用PDA液體培養(yǎng)基(裝液量100mL/250mL,pH自然);富士蘋果采自于甘肅慶陽靜寧縣;氯化銨分析純,天津奧博凱化工有限公司;蛋白胨生化試劑,北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司;磷酸氫二銨分析純,天津光復精細化工研究所;L-精氨酸生化試劑,天津光復精細化工研究所;焦亞硫酸鈉分析純,天津市恒興化學試劑制造有限公司。2WY-2102型恒溫培養(yǎng)箱、ZHJH-C11128型超凈工作臺上海智城分析儀器制造有限公司;TD50002型電子天平余姚市金諾天平儀器有限公司;B204LED型生物顯微鏡重慶奧特光學儀器有限公司;YXQ-LS-75G型立式壓力蒸汽滅菌鍋上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;RE5205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠;Breville-BJE500F型榨汁機澳大利亞鉑富公司。1.2實驗方法1.2.1工藝1.2.2存儲液的制備將釀酒酵母保藏菌種轉(zhuǎn)接于新鮮試管斜面,28℃培養(yǎng)48h;4℃冰箱保存?zhèn)溆?。從保存的斜面培養(yǎng)基中用接種環(huán)挑去6環(huán)菌苔接種于裝有100mL液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中,28℃、150r/min搖床培養(yǎng)48h,4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.2.3氮源種類對裝復量的影響在蘋果白蘭地酒發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同濃度的氯化銨、蛋白胨、磷酸氫二銨、L-精氨酸作為氮源,每種氮源設(shè)置對照、100、150、250、400、550、700mg/L七個水平,分別裝于1000mL三角瓶,每瓶600mL,重復3次。1.2.4蘋果白蘭地酒發(fā)酵培養(yǎng)制度將活化好的兩種釀酒酵母按照1∶1比例接種于600mL蘋果白蘭地酒發(fā)酵培養(yǎng)基中,接種量為6%,接種濃度為106cfu/mL,然后于20℃下厭氧靜置發(fā)酵6d。1.2.5分析1.2.5.1.糖、總酸和酒精的測定依據(jù)GB/T15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》對糖量、總酸、酒精度等理化指標進行測定。1.2.5.酵母發(fā)酵力的測定采用失重法,以單位體積和時間下二氧化碳揮發(fā)產(chǎn)生的失重來衡量酵母發(fā)酵力的大小,即酵母發(fā)酵力(g/(L·h))=(發(fā)酵前稱重-發(fā)酵后稱重)/(發(fā)酵液體積·發(fā)酵時間)。1.2.6數(shù)據(jù)分析2結(jié)果與分析2.1對二氧化碳釋放的影響酵母發(fā)酵力是指酵母產(chǎn)酒精的能力,在厭氧條件下酵母產(chǎn)生酒精與二氧化碳,發(fā)酵結(jié)束二氧化碳揮發(fā)產(chǎn)生失重,以失重來衡量酵母發(fā)酵力的強弱。不同氮源處理對蘋果白蘭地酒精發(fā)酵力的影響如圖1~圖4所示。由圖1~圖4可知,各處理的酵母發(fā)酵力均顯著高于對照(p<0.05),其中,氯化銨處理為250mg/L時二氧化碳釋放量最大,而與700、550、400mg/L處理相比差異不顯著(p>0.05);蛋白胨處理為400mg/L時二氧化碳釋放量最大,與150、100mg/L及對照濃度處理相比差異顯著(p<0.05);磷酸氫二銨處理為250mg/L時二氧化碳釋放量最大,與550、400mg/L處理相比差異不顯著(p>0.05);L-精氨酸處理為550mg/L時二氧化碳釋放量最大,而與250mg/L處理相比差異不顯著(p>0.05)。由圖1~圖4可知,與對照二氧化碳失重量較低,相比較,添加氮源可以明顯加快發(fā)酵速度,增加二氧化碳失重量,提高酵母酒精發(fā)酵力,且無機氮源酵母酒精發(fā)酵力低于有機氮源。2.2其他處理殘?zhí)橇繗執(zhí)鞘蔷凭l(fā)酵后未被發(fā)酵而殘余的糖,殘?zhí)歉叩褪呛饬烤凭l(fā)酵完全程度的重要指標。殘?zhí)瞧咭馕吨a(chǎn)酒率偏低,糖不能有效地轉(zhuǎn)化為酒精。不同氮源處理對蘋果白蘭地酒精發(fā)酵殘?zhí)堑挠绊懭鐖D5~圖8所示。由圖5~圖8可以看出,除了蛋白胨100mg/L處理對殘?zhí)堑挠绊懪c對照無明顯差異外,其他三個處理的各個濃度與對照相比差異均顯著(p<0.05)。其中,氯化銨和磷酸氫二銨添加量均為250mg/L時殘?zhí)橇孔钚?但250mg/L氯化銨與550、400mg/L處理相比差異不顯著(p>0.05),250mg/L磷酸氫二銨與400mg/L處理相比差異不顯著(p>0.05);蛋白胨添加量為400mg/L時殘?zhí)橇孔钚?與550mg/L差異不顯著(p>0.05);而L-精氨酸處理為550mg/L時殘?zhí)橇孔钚?與700、250mg/L處理相比差異不顯著(p>0.05)。實驗結(jié)果表明,同空白對照降糖較慢相比,添加氮源可以加速糖的降解,提高糖酒轉(zhuǎn)化率,增加酒精產(chǎn)量。從圖5~圖8中還可以看出發(fā)酵后糖利用率整體偏低,經(jīng)分析認為可能是初始發(fā)酵糖度過高,隨著酒精濃度的增加,酵母容易受到高濃度酒精的抑制,從而不能充分利用發(fā)酵液中的糖,導致糖利用率偏低。2.3發(fā)酵溫度和氮源濃度對發(fā)酵酒精度的影響酒精度表示酒中含乙醇的體積百分數(shù),體積百分數(shù)越大,說明酵母發(fā)酵糖產(chǎn)生的乙醇越多。不同氮源處理對蘋果白蘭地發(fā)酵酒精度的影響如圖9~圖12所示。從圖9~圖12結(jié)果可以看出,除了蛋白胨及磷酸氫二銨100mg/L處理的酒精度分別低于、與對照無差異以外,其他各處理的酒精度均顯著高于對照(p<0.05),其中,氯化銨和磷酸氫二銨處理都為250mg/L時酒精度最高,但氯化銨與400mg/L處理相比差異不顯著(p>0.05),而磷酸氫二銨則與700、400、150mg/L處理相比差異不顯著(p>0.05);蛋白胨處理為400mg/L時酒精度最高,與700、550mg/L處理相比差異不顯著(p>0.05);而L-精氨酸處理為550mg/L時酒精度最高,與700、250mg/L處理相比差異不顯著(p>0.05)。由圖9~圖12結(jié)果可知,在相同的發(fā)酵條件下,無機氮源發(fā)酵酒精度低于有機氮源,其中無機氮源中以氯化銨在水平250mg/L下酒精度最高,有機氮源中以蛋白胨在水平400mg/L下酒精度最高。因為蘋果汁中氮的含量是影響酵母生長及發(fā)酵速率的主要因素,低溫發(fā)酵時有機氮源氨基酸在酵母對數(shù)期時可被大部分利用,而無機氮源更多的是用于酵母生物量的生成。Beltran等的研究結(jié)果表明,有機氮源氨基酸在整個發(fā)酵過程中對酵母細胞代謝非常重要,而無機氮源銨鹽則在發(fā)酵后期很難被利用,以上研究結(jié)果支持本實驗有機氮源發(fā)酵酒精度高于無機氮源的結(jié)果。以上結(jié)果還表明,氮源濃度在150mg/L以上發(fā)酵酒精度與對照相比有顯著差異,但隨著氮源濃度的增加,酒精含量并不與氮源濃度呈直線關(guān)系。氮源不足會導致酒精發(fā)酵緩慢甚至停滯現(xiàn)象的發(fā)生,其他一些研究證實,防止發(fā)酵不徹底的氮源最小值大概是140mg/L,而在實際發(fā)酵中,氮源的最小值還受酵母菌種、生長繁殖條件及發(fā)酵環(huán)境的影響,這個結(jié)論只是一個粗略估計。而足量的氮源可以提高酵母菌的發(fā)酵速率并可以縮短發(fā)酵周期,但氮源濃度過高也會導致酒精度的下降,因為氮源濃度過高會使發(fā)酵過程出現(xiàn)氮分解代謝產(chǎn)物阻遏(NCR)狀態(tài),而此狀態(tài)會降低銨鹽和氨基酸透性酶基因(GAP1和MEP2)的表達,影響細胞對氮源的轉(zhuǎn)移及吸收,由于NCR狀態(tài)下氮與糖的代謝高度相關(guān),同樣也會影響糖代謝進而不利于酒精的積累,同時過量的氮源會造成微生物危害及生物胺生成,對酒的穩(wěn)定性及品質(zhì)產(chǎn)生消極影響。2.4不同氮源、對總酸的影響蘋果白蘭地總酸是蘋果原汁酸和酵母代謝酸的總和,蘋果白蘭地總酸的高低,關(guān)系到蘋果白蘭地酒的質(zhì)量和口感,不同氮源處理對蘋果白蘭地酒精發(fā)酵總酸的影響如圖13所示?？偹嶙兓渴侵柑O果白蘭地酒發(fā)酵前后總酸含量的差值,本實驗在蘋果白蘭地酒發(fā)酵過程中,處理及對照總酸變化量都有所增加。由圖13可以看出,無機氮源發(fā)酵后總酸變化量較有機氮源明顯,個別濃度處理的總酸變化量與對照相比差異顯著(p<0.05),并隨著氮源濃度增加總酸變化量有增加的趨勢,經(jīng)分析認為氯化銨和磷酸氫二銨都是生理酸性氮源,氨氮利用后游離出來的酸根使發(fā)酵后總酸增加;而有機氮源不同濃度處理后的總酸變化量與對照相比,不但沒有顯著增加,反而多數(shù)濃度處理后的總酸變化量低于對照。因此,酒精發(fā)酵過程中,總酸可以受到不同氮源及濃度的影響。3發(fā)酵過程中酵母粉添加量的變化3.1蘋果白蘭地酒精發(fā)酵中適當添加氮源對蘋果白蘭地酒發(fā)酵有一定促進作用。在相同的發(fā)酵條件下,添加氮源可以提高酵母酒精發(fā)酵力,加速糖的降解,提高糖的轉(zhuǎn)化率。3.2無機氮源發(fā)酵酒精度低于有機氮源,添加氮源后,氮源濃度在150mg/L以上發(fā)酵酒精度與對照差異顯著,但隨著氮源濃度的增加,酒精含量并不與氮源濃度呈直線關(guān)系,其中無機氮源中以氯化銨在水平250mg/L下酒精度最高,有機氮源中以蛋白胨在水平400mg/L下酒精度最高。3.3發(fā)酵過程中總酸的變化受蘋果汁中氮源種類及濃度的影響,無機氮