玫瑰花根多糖的提取純化及抗氧自由基能力的研究

玫瑰花根多糖的提取純化及抗氧自由基能力的研究

糖是自然界最常見(jiàn)的物質(zhì)之一。它也是一個(gè)與人類(lèi)生活密切相關(guān)的生物分子。大量藥理及臨床研究證明,多糖有免疫促進(jìn)、抗癌、抗肥胖、控制血糖、降膽固醇、降血脂、抗衰老、抗凝血等生理功能,作為綠色生物醫(yī)藥產(chǎn)品具有廣闊的市場(chǎng)前景。研究發(fā)現(xiàn)植物多糖具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗病毒和抗氧化的多種活性,其中抗氧化的主要機(jī)制與清除自由基等作用有關(guān)。在某些病理情況下,由于自由基具有很高的反應(yīng)活性,因此它將在分子、細(xì)胞乃至器官水平給機(jī)體造成損傷,從而加快機(jī)體的衰老過(guò)程,并可誘導(dǎo)癌癥、心血管疾病等疾病的發(fā)生。茉莉花根(JasminumsambacAiton)為木犀科(Oleaccae)素馨屬(JasminumLinn.)植物茉莉[Jasminumsambac(L.)Aiton]的根。茉莉花根、莖、葉、花全身是寶,均有藥用價(jià)值。《本草綱目》載:“茉莉花根,凡跌傷、骨折、脫臼、接骨者用此,則不知痛也”,其藥理價(jià)值在《現(xiàn)代實(shí)用中藥》也有收載。茉莉花根目前主要為民間用藥,主治跌傷筋骨脫臼引起的劇烈疼痛、頭頂痛、失眠等癥狀,古代醫(yī)家曾將茉莉花根作為鎮(zhèn)痛藥方中的一種成分而應(yīng)用。茉莉花根的化學(xué)成分較復(fù)雜,主要含有揮發(fā)油、脂肪酸、脂肪醇、酚類(lèi)、還原糖、多糖及其苷、黃酮類(lèi)、甾體類(lèi)、環(huán)烯醚萜苷類(lèi)、生物堿等。自19世紀(jì)60年代以來(lái),對(duì)茉莉花根多糖的提取工藝研究相對(duì)較少,且對(duì)其多糖抗氧自由基的研究尚未見(jiàn)報(bào)道,限制了茉莉花根的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用等問(wèn)題,因此我們進(jìn)一步研究了它的新的活性成分多糖的抗氧自由基活性作用,為新藥的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供參考。1材料和機(jī)器1.1合成工藝參數(shù)茉莉花干品根:采自廣西橫縣;無(wú)水乙醇、氯仿、正丁醇、活性炭、硫酸、苯酚、鹽酸、鄰苯三酚、雙氧水、硫酸亞鐵、水楊酸等均為分析純;葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品:J&KCHEMICALLTD。1.2精密設(shè)備和測(cè)試儀器HC·TP12A-1架盤(pán)藥物天平:北京醫(yī)用天平廠;電子天平:上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司;DHG-9070A型電熱恒溫旋風(fēng)干燥箱:上海精密設(shè)備有限公司;電熱式恒溫水浴鍋(箱):江蘇金壇宏凱儀器廠;循環(huán)水真空抽氣泵:上海嘉鵬科技有限公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:上海安亭實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;78WH-1恒溫磁力攪拌器:杭州藍(lán)天化驗(yàn)儀器廠;722N紫外分光光度計(jì):上海精密科學(xué)儀器有限公司。2方法2.1茉根多糖的提取稱(chēng)量茉莉花根干品粉末100g置于蒸餾燒瓶中,加蒸餾水后于室溫中浸泡30min后,置于恒溫水浴鍋,在78℃加熱提取,濾渣反復(fù)提取2次,每次提取時(shí)間分別為3、2h,將每次提取液合并,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮至一定體積,再加入3倍體積的無(wú)水乙醇密封,靜置一夜后抽濾,濾餅即為茉莉花根多糖粗品。2.2茉莉花根提取精華的糖2.2.1多糖提取液將多糖粗品置于燒杯中,用一定量蒸餾水充分溶解,再加入適量活性炭,于78℃水浴鍋中攪拌30min后過(guò)濾,重復(fù)脫色2次,得脫色后的多糖粗品溶液。2.2.2正丁醇分液處理加入相當(dāng)于前一步驟所得多糖粗品水溶液1/4體積的氯仿,再加人相當(dāng)于氯仿的1/4體積的正丁醇,將混合物劇烈震蕩約30min,然后離心,通過(guò)分液漏斗除去水層和溶劑層之間的變性蛋白,如此重復(fù)幾次,直至將蛋白質(zhì)充分除盡。將除去蛋白質(zhì)的多糖溶液用恒溫磁力攪拌器濃縮成膏狀后,用電熱恒溫旋風(fēng)干燥箱烘干,即得多糖樣品。2.3蓮花根糖樣品中的純糖含量測(cè)定2.3.1苯酚溶液的配制1)精密量取12.5mL苯酚,置于250mL容量瓶中,加蒸餾水定容,得5.0%的苯酚溶液。2)精確稱(chēng)量0.010g葡萄糖,置于100mL容量瓶中,加蒸餾水定容,得0.1mg/mL的葡萄糖溶液。2.3.2樣品溶液的制備精密稱(chēng)取0.011g多糖樣品于小燒杯中溶解后移至100mL容量瓶中,加蒸餾水定容至刻度,即為待測(cè)樣品溶液。2.3.3對(duì)照品溶液的制備精密量取葡萄糖對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)溶液依次為5.00、10.00、20.00、30.00、35.00mL,分別置于50mL容量瓶中,加蒸餾水定容至刻度,分別稀釋成10、20、40、60、70μg/mL的5個(gè)不同濃度的對(duì)照品系列溶液。分別準(zhǔn)確量取1.00mL對(duì)照品液5份,分別置于5個(gè)具塞試管中,加1.50mL苯酚溶液,再加7.50mL濃硫酸溶液,混合均勻后放置20min,用722N型可見(jiàn)-紫外分光光度計(jì),在486nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度,以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),建立回歸方程。2.3.4回歸方程精確稱(chēng)量茉莉花根多糖0.218g置小燒杯中溶解,移至100mL容量瓶中,加蒸餾水定容至刻度,再精密量取1.00mL于另一個(gè)100mL容量瓶中,加蒸餾水定容至刻度。精密量取該儲(chǔ)備液1.00mL,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)項(xiàng)下的方法在486nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度,根據(jù)回歸方程計(jì)算出多糖中葡萄糖的濃度,再按下式計(jì)算出換算因子。校正因子的計(jì)算:式中:C為曲線(xiàn)回歸方程計(jì)算濃度,(μg/mL);D為儲(chǔ)備液的稀釋倍數(shù);V為多糖樣品的溶解體積,mL;W為所取多糖樣品質(zhì)量,g。測(cè)定吸光度A=0.144,則由回歸方程和上式公式計(jì)算得校正因子F=2.07(n=3)。2.3.5回歸方程精密吸取樣品溶液1.00mL,同時(shí)做3個(gè)重復(fù),按照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)項(xiàng)下的方法在486nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度,根據(jù)回歸方程和以下的含量計(jì)算公式計(jì)算出樣品中多糖的百分含量。多糖含量=[C×D×F×10-6/W]×100%式中:C為曲線(xiàn)回歸方程計(jì)算濃度,(μg/mL);D為樣品溶液的稀釋體積;F為校正因子;W為所取多糖樣品的質(zhì)量,g。2.4抗氧化性測(cè)定2.4.1清除oh的實(shí)驗(yàn)大量研究表明,羥基自由基(·OH)具有極強(qiáng)的氧化能力,它能導(dǎo)致生物體內(nèi)DNA,蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化損傷,對(duì)生物組織產(chǎn)生極強(qiáng)的危害作用。本文通過(guò)Fenton法研究茉莉花根多糖對(duì)羥基自由基(·OH)的清除作用。用Fenton反應(yīng)法產(chǎn)生羥基自由基(·OH)。H2O2/Fe2+體系可通過(guò)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生經(jīng)自由基化學(xué)反應(yīng)如下:用·OH氧化水楊酸產(chǎn)生有色物質(zhì),該產(chǎn)物在510nm處有強(qiáng)吸收峰,若體系中加入清除·OH的物質(zhì),則會(huì)減少有色物質(zhì)的生成,吸收度降低。吸光度越低,清除·OH效果越好。測(cè)量過(guò)程:取6支試管并依次編號(hào)為1、2、3、4、5、6。每支試管各加9mmol/LFeSO41mL,9mmol/L水楊酸-乙醇溶液2.00mL,再按編號(hào)1號(hào)~5號(hào)試管各加不同濃度的茉莉花根多糖溶液2.00mL,6號(hào)管加2.00mL蒸餾水作空白對(duì)照,最后加入8.8mmol/LH2O22.00mL啟動(dòng)反應(yīng),在室溫下反應(yīng)1h。以蒸餾水作參比,于510nm處測(cè)定其吸光度,并與空白液比較,便能測(cè)定被測(cè)物對(duì)OH·的清除效果。其清除率計(jì)算式如下:式中:A0為空白對(duì)照液的吸光度;As為加入提取液后的吸光度。2.4.2鄰苯三酚自氧化曲線(xiàn)及清除家庭暴力速率研究證明,超氧陰離子是一種強(qiáng)氧化性的自由基,有細(xì)胞毒作用,能與其它自由基結(jié)合進(jìn)一步對(duì)生物組織產(chǎn)生毒害作用,因此研究茉莉花根多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用在生物損傷方面有著重要意義。本文通過(guò)鄰苯三酚自氧化法研究茉莉花根多糖對(duì)O2-·自由基的清除能力。1)不加多糖樣品溶液鄰苯三酚自氧化曲線(xiàn)的測(cè)定:取緩沖液(Tris-HCl緩沖溶液pH8.2)4.50mL,加入4.20mL蒸餾水,混勻后在25℃水浴中保溫20min,取出后立即加入在25℃水浴中預(yù)熱過(guò)的3mmol/L的鄰苯三酚0.30mL(以緩沖液代替鄰苯三酚作為空白),混勻后立即倒入比色杯,于特征波長(zhǎng)321nm處測(cè)定吸光度隨時(shí)間的變化曲線(xiàn),得鄰苯三酚自氧化曲線(xiàn)。2)加入多糖樣品后鄰苯三酚自氧化曲線(xiàn)的測(cè)定:依上法實(shí)驗(yàn),在加入鄰苯三酚前先加入1.00mL的茉莉花根多糖溶液,再加入3.20mL蒸餾水,混合均勻后在25℃水浴中保溫20min,取出后立即加入在25℃水浴中預(yù)熱過(guò)的3mmol/L的鄰苯三酚0.30mL,混勻后立即倒入比色杯,于特征波長(zhǎng)處測(cè)定加入茉莉花根多糖樣品后鄰苯三酚自氧化曲線(xiàn)。根據(jù)鄰苯三酚自氧化曲線(xiàn)在線(xiàn)性范圍內(nèi)每20秒吸光度的增加(用線(xiàn)性回歸法求得)即反應(yīng)速率V,清除率計(jì)算如下:式中:V為加入多糖樣品溶液后反應(yīng)速率;V0為不加多糖樣品溶液時(shí)鄰苯三酚自氧化速率。3結(jié)果與分析3.1茉根多糖測(cè)定的結(jié)果葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制和多糖含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1和圖1。由表1可繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),求得回歸方程如下:由圖1可知:A=0.0093x+0.0467,相關(guān)系數(shù)R2=0.9992,說(shuō)明葡萄糖在所取濃度范圍內(nèi)其濃度和吸光度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。茉莉花根多糖溶液的吸光度測(cè)定結(jié)果如表2。根據(jù)回歸方程由多糖含量計(jì)算公式和上表可計(jì)算得出茉莉花根多糖樣品中純多糖含量為69.2%。3.2茉莉花多糖對(duì)h2/fe2+體系的最佳用量茉莉花根多糖清除·OH作用的結(jié)果見(jiàn)表3和圖2。由上表可繪制不同濃度的茉莉花根多糖對(duì)·OH的清除率變化曲線(xiàn)圖如圖2。結(jié)果表明,不同濃度的茉莉花根多糖對(duì)H2O2/Fe2+體系通過(guò)Fenton法反應(yīng)產(chǎn)生的·OH都具有清除作用,且隨濃度的增加,清除率不斷升高,即清除率與多糖的用量存在一定的量效關(guān)系。在低濃度時(shí),隨濃度的增加,清除率明顯升高。3.3茉莉花根可以去除超氧化鉀的作用3.3.1茉根多糖對(duì)鄰苯三酚自氧化反應(yīng)的加速作用加入不同濃度多糖樣品對(duì)鄰苯三酚自氧化曲線(xiàn)的影響見(jiàn)圖3。由圖3可看出加入多糖樣品后鄰苯三酚自氧化反應(yīng)曲線(xiàn)和加入多糖樣品前的鄰苯三酚反應(yīng)曲線(xiàn)變化趨勢(shì)相同,但變化速度和幅度不同。很明顯,加入多糖樣品后,A321值達(dá)到最高值時(shí)間均有不同程度的提前,說(shuō)明茉莉花根多糖樣品的加入可加速鄰苯三酚自氧化反應(yīng)的進(jìn)行,推測(cè)其可能由于茉莉花根多糖對(duì)O2-·具有清除作用,使反應(yīng)體系中O2-·濃度減小,從而加速了鄰苯三酚自氧化反應(yīng)的進(jìn)行。加0.218%多糖樣品時(shí)自氧化回歸直線(xiàn)方程見(jiàn)圖5。加0.008%多糖樣品時(shí)自氧化回歸直線(xiàn)方程見(jiàn)圖6。由圖4、圖5、圖6可知各回歸曲線(xiàn)的斜率在數(shù)值上等于反應(yīng)速率V,則:0.218%多糖的清除率S=(V-V0)/V0=28%;0.800%多糖的清除率S=(V-V0)/V0=36%。從圖4、圖5、圖6可知,茉莉花根不同多糖濃度對(duì)鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生的O2-·自由基具有清除作用,在0.218%多糖濃度時(shí)達(dá)28%,而在0.800%時(shí)就達(dá)36%?？梢?jiàn),在一定范圍內(nèi),隨多糖濃度的增加清除率不斷提高。4體外抗氧自由基能力茉莉花根經(jīng)提取純化后所得的多糖樣品中純多糖的含量高達(dá)69.2%,說(shuō)明熱水浸提法、醇沉法及Sevage法對(duì)茉莉花根多糖提取和純化效果較好;茉莉花根多糖對(duì)O2-·自由基和·OH自由基的清除作用均較強(qiáng),具有明顯的抗氧自由基能力。大量研究已表明,過(guò)多的活性氧自由基