淺析我國(guó)登革病毒疫苗的現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì)

淺析我國(guó)登革病毒疫苗的現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì)

據(jù)報(bào)道，生活在亞熱帶和亞熱帶地區(qū)的40%的人口受到了登格熱感染的威脅，尤其是報(bào)告的感染病例逐年增加。在過去的50年里,伴隨著全球氣溫的升高,登革熱的發(fā)病率增加了近30倍,發(fā)病的區(qū)域已擴(kuò)展到一些新的國(guó)家,并從城市延伸到農(nóng)村。登革熱發(fā)病率的猛速增長(zhǎng),使其成為了一個(gè)全球性的健康問題。美國(guó)過去30年病例報(bào)道中,登革熱病例就增加了4.6倍,登革出血熱病例增加了8.3倍;1997-2007年間,登革熱在巴西的案例就有4818件,其中83.6%的案例發(fā)生在2007年。迄今,還沒研制出一種許可疫苗應(yīng)用于臨床。也正因?yàn)槿绱?除了許多國(guó)家和行業(yè)外,小兒登革熱疫苗行動(dòng)(PDVI)、WHO和美國(guó)軍方也開始了緊密合作,希望能夠加快研制出一種既安全又有效的登革疫苗。登革熱發(fā)病的區(qū)域主要集中于熱帶和亞熱帶地區(qū)(如東南亞:泰國(guó)、印尼、新加坡和越南;南美洲:委內(nèi)瑞拉和巴西;中美洲:巴拿馬、薩爾瓦、洪都拉斯、多米尼加共和國(guó)和尼加拉瓜;西太平洋:柬埔寨、馬來群島等;非洲:索馬里賽舍島和坦桑尼亞),特別是在東南亞和太平洋西部。據(jù)相關(guān)報(bào)道,登革熱已成為某些國(guó)家兒童住院和死亡的首要因素。在北非和東南亞的國(guó)家中,由于不可控制的人口增長(zhǎng)使得城鄉(xiāng)易感人群不斷增加;熱帶地區(qū)國(guó)家非托管的城市化進(jìn)程快速發(fā)展給伊蚊提供了一個(gè)舒適的繁殖環(huán)境;對(duì)一次性容器、舊輪胎和一些可以積集雨水或廢水的物體等固體垃圾的管理不善給予伊蚊幼蟲一個(gè)合適的生長(zhǎng)地方;各國(guó)商務(wù)的頻繁往來也增加了病原體傳播的可能性。種種可能引發(fā)登革熱感染因素的存在,使得登革熱愈來愈受到各國(guó)政府和各行業(yè)的關(guān)注,同時(shí)也推動(dòng)了登革疫苗的研究進(jìn)程。登革熱疫苗開始研制可以追溯到20世紀(jì)20年代。當(dāng)今,疫苗的開發(fā)主要包括了活疫苗(如經(jīng)典的減毒疫苗、定向誘變疫苗、登革熱和登革黃熱病嵌合體)、滅活疫苗(重組E蛋白亞基和純化滅活病毒)和NDA疫苗。1dem的結(jié)構(gòu)蛋白登革熱是一種由登革病毒(denguevirus,DEN)引起的急性傳染病,主要以埃及伊蚊和白文伊蚊作為媒介進(jìn)行傳播,其臨床特征常表現(xiàn)為突起高溫、頭痛,全身肌肉、骨骼和關(guān)節(jié)疼痛,皮疹,出血傾向及白細(xì)胞計(jì)數(shù)減少,與基孔肯雅熱相似?？煞譃榈歉锍鲅獰?denguehemorrhagicfever,DHF)和登革熱休克綜合征(dengueshocksyndrome,DSS)。DHF是一種嚴(yán)重類型的登革熱,臨床表現(xiàn)為高熱、嚴(yán)重出血、血小板計(jì)算減少、血漿濃縮,病死率高。同時(shí)伴有休克表現(xiàn)的DHF稱為DSS。DEN屬于黃病毒科黃病毒屬,有4個(gè)血清型(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4),它們的同源序列高達(dá)65%~70%,每種血清型都能引起登革熱、DHF和DSS。DEM是一種單股正鏈RNA病毒。其RNA長(zhǎng)約10.6kb,包含1個(gè)開放讀碼框(ORF),編碼含3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白的包括近35000個(gè)氨基酸的聚蛋白前體(NH2-C-prM-E-NS1-NSA-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-COOH)。DEM為球形顆粒,直徑約50nm,核心直徑約27nm,毒粒包膜的外表面是一些長(zhǎng)5~10nm的突起物。每個(gè)病毒粒均含有1個(gè)單位膜和1個(gè)內(nèi)部核心結(jié)構(gòu)(核衣殼)。E蛋白(約55KDa)是DEM最大的結(jié)構(gòu)蛋白,可介導(dǎo)病毒與易感宿主細(xì)胞的吸附和穿入。通過X射線晶體衍射技術(shù),可知道E蛋白是由2個(gè)單聚體組成的同源二聚體,每個(gè)單聚體可折疊成3個(gè)不同的區(qū)域,稱為結(jié)構(gòu)域Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ區(qū)。其中結(jié)構(gòu)域Ⅱ區(qū)很有可能參與二聚體的形成及膜整合過程,且被認(rèn)為是許多黃病毒組和亞組交叉反應(yīng)的抗原。DEM的4個(gè)血清型之間存在著廣泛的血清學(xué)交叉反應(yīng),這種亞組反應(yīng)性抗原表位不僅存在于病毒的結(jié)構(gòu)蛋白上,也存在于非結(jié)構(gòu)蛋白上。研究表明,結(jié)構(gòu)域Ⅲ區(qū)很可能是細(xì)胞受體的結(jié)合位點(diǎn),此結(jié)構(gòu)域的突變會(huì)引起病毒毒力的減弱和逃避機(jī)體的免疫捕獲。但同時(shí)也有研究表明,E蛋白Ⅲ區(qū)對(duì)病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合作用并非具有獨(dú)立性。減毒活疫苗往往從單一的疫苗,傾向于能模擬機(jī)體自然感染,誘導(dǎo)機(jī)體免疫而獲得較為持久的免疫能力。傳統(tǒng)減毒途徑是將病毒在非宿主細(xì)胞或動(dòng)物體內(nèi)連續(xù)傳代使其減毒。減毒活疫苗是一種活的病毒,能使被免疫的機(jī)體產(chǎn)生結(jié)構(gòu)性和非結(jié)構(gòu)性的抗體。借鑒于其他黃科病毒和日本腦炎病毒成功開發(fā)減毒活疫苗的經(jīng)歷,用4種血清型的DEM毒株潛在開發(fā)成減毒活疫苗,已被廣泛認(rèn)同。通過這種技術(shù),目前,一些候選疫苗正在開發(fā)中。1954年,通過用DEN-1免疫小鼠的大腦,首次獲得了DEM減毒活疫苗,但不管是后來所采用PDK細(xì)胞傳代培養(yǎng)產(chǎn)生減毒疫苗,均會(huì)使自愿者產(chǎn)生皮疹。不同病毒株的減毒效果不同,細(xì)胞傳代會(huì)使病毒產(chǎn)生不可預(yù)測(cè)的分子突變,種種問題的存在,阻止了減毒疫苗的發(fā)展。目前,通過這種連續(xù)傳代的方法獲得多株減毒株,如有DEN-1的45AZ5減毒株、DEN-2的16681PDK53減毒株和DEN-4的341750Carib減毒株等。華盛頓特區(qū)沃爾特里德軍事研究所(WRAIR)和葛蘭素史克(GSK)將DEM在PDK細(xì)胞連續(xù)稀釋,再通過胎兒恒河猴肺細(xì)胞連續(xù)傳代,最后用于恒河猴的動(dòng)物實(shí)驗(yàn),目前,WRAIR進(jìn)行了4個(gè)血清型的單價(jià)疫苗的人體實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞傳代培養(yǎng)獲得的毒株因接種的血清型不同而表現(xiàn)出不同減毒效率,傳統(tǒng)減毒途徑難以把握毒株的減毒效率,減毒疫苗會(huì)因減毒效率低或過于減毒而失去其免疫原性,而減毒活疫苗效率高則會(huì)引發(fā)登革熱,因此這種傳統(tǒng)的減毒途徑難以滿足目前對(duì)減毒疫苗研制的需要。近年來,反向遺傳學(xué)技術(shù)的成熟發(fā)展,基因突變或稱為嵌合減毒的技術(shù)逐漸取代了傳統(tǒng)的細(xì)胞傳代減毒方法?？茖W(xué)家們猜想,是否能在DEM的基因組中定位插入一段已知片段,干擾病毒的復(fù)制轉(zhuǎn)錄能力,從而使病毒具有較高的免疫原性和最低限度的免疫反應(yīng)性。DEM感染性全長(zhǎng)cDNA克隆的構(gòu)建成功和病毒基因組中相關(guān)位點(diǎn)的不斷深入研究,使得通過缺失或定點(diǎn)誘變來對(duì)病毒定向減毒成為可能。然而,目前的許多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,解決減毒效率與機(jī)體自身免疫之間的平衡問題存在相當(dāng)大的難度,并且突變株有可能恢復(fù)到原來的野生株。機(jī)體感染一種亞型的DEM后可以產(chǎn)生對(duì)該種亞型病毒的終身免疫能力,出現(xiàn)異型的二次感染會(huì)引起更為嚴(yán)重的登革熱,甚至出現(xiàn)DHF或DSS。當(dāng)今,科學(xué)家們對(duì)DHF的發(fā)病機(jī)理存在著2種不同的觀點(diǎn);其一,由異型DEM二次感染導(dǎo)致的抗體依賴性增強(qiáng)所致;其二,由病毒毒力改變所致。干擾4種血清型DEM的復(fù)制能力可能會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫的失衡,產(chǎn)生一些不必要的免疫病理反應(yīng)。在旅客的調(diào)查中發(fā)現(xiàn),初次感染和二次感染DEM引起登革熱和DHF的機(jī)率很接近,所以流行病學(xué)認(rèn)為對(duì)DHF的發(fā)病機(jī)制還需要進(jìn)一步研究討論。對(duì)4種血清型DEM復(fù)制能力的干擾,會(huì)使病毒的感染能力喪失或增加,所以四價(jià)疫苗的配方必須克服病毒的感染能力和機(jī)體自身免疫的失衡問題。2dem-80e基因的嵌合病毒的重組另一種構(gòu)建登革疫苗的有效方法就是利用分子遺傳學(xué),以黃病毒屬家族,如黃熱病毒,或以減毒登革病毒株為骨架,再?gòu)?種血清型病毒中替換出同源序列(主要是prM-E)的重組嵌合毒株,從而獲得合適的減毒效率和較高的免疫原性。作為骨架必須包含DEM的結(jié)構(gòu)蛋白C、非結(jié)構(gòu)蛋白和登革病毒RNA的5′-UTR和3′-UTR。美國(guó)NIHNIAID的La等以4型登革熱病毒的cDNA克隆為骨架,再將1型、2型和3型登革熱病毒的C-prM-E基因替換4型登革熱病毒的相應(yīng)片段,從而獲得了登革1-4型、登革2-4型和登革3-4型的嵌合疫苗。隨后,將登革1-4型和登革2-4型的嵌合毒株分別或混合免疫恒河猴。結(jié)果表明,不論是單價(jià)還是混合后對(duì)恒河猴的免疫均可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異的中和抗體,并能抵抗DEN-1和DEN-2致死劑量的攻擊。WRAIR通過截短重組DEM包膜蛋白亞基(80E),并在果蠅施耐德-2(S2)細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)中得到高效表達(dá)。通過X射線晶體結(jié)構(gòu)分析表明,重組80E亞基的折疊類似于自然狀態(tài)。之后把重組80E亞基分別克隆到4種血清型的登革熱病毒基因組中,并與佐劑配伍后,免疫小鼠并表現(xiàn)出高滴度病毒中和抗體反應(yīng)。重組后的4種血清型的DEM再進(jìn)行配伍,獲得四價(jià)登革疫苗后,免疫小鼠,再分別用4種血清型的DEM進(jìn)行作用,同樣能夠得到高滴度的中和抗體?；谠诠塖2細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的80E亞基,這些結(jié)果促進(jìn)了四價(jià)登革病毒疫苗的發(fā)展。目前,在臨床試驗(yàn)中做得最為成功的重組嵌合疫苗是嵌合Vax登革減毒疫苗,它是以黃熱病毒17D株(YF-17)為骨架,分別將4種血清型的登革病毒的prM-E基因替換感染性克隆相應(yīng)基因構(gòu)建了DEN-1/YF、DEN-2/YF、DEN-3/YF和DEN-4/YF嵌合病毒。Aca-mibis公司和Mahidol大學(xué)基于DEN/YF嵌合策略構(gòu)建的4個(gè)血清型的嵌合病毒,配伍成四價(jià)疫苗。臨床試驗(yàn)顯示,該四價(jià)疫苗在機(jī)體內(nèi)具有良好的免疫原性、很低的反應(yīng)原性和病毒血癥。目前已進(jìn)入了臨床Ⅱ期研究階段。3dem在登革病毒dna疫苗中的應(yīng)用登革DNA疫苗主要是將登革病毒的prM-E和NS1作為靶基因克隆到真核表達(dá)載體上,然后將重組的質(zhì)粒直接注射到動(dòng)物體內(nèi),使靶基因在活體內(nèi)表達(dá),產(chǎn)生抗原啟動(dòng)機(jī)體免疫系統(tǒng),引起免疫反應(yīng)。4種血清型病毒的E蛋白Ⅲ區(qū)基因片段分別克隆pcDNA3質(zhì)粒的重組質(zhì)粒,檢測(cè)在COS-7細(xì)胞中的表達(dá)情況。每種質(zhì)?；蛩膬r(jià)重組體通過肌肉注射免疫BALB/c小鼠,結(jié)果表明,以E蛋白Ⅲ區(qū)基因片段制定1個(gè)四價(jià)DNA疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體保護(hù)。賓夕法尼亞州學(xué)校的病理與檢驗(yàn)科Mathura等人,通過4種血清型病毒的E蛋白Ⅲ區(qū)基因片段分別克隆到含有1個(gè)開放讀碼框的哺乳動(dòng)物的載體中,稱為pDV-U-DⅢ,配伍成四價(jià)DNA疫苗。并能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生對(duì)4種血清型的中和抗體,防止細(xì)胞受病毒的感染而死亡。DNA疫苗在其他疾病動(dòng)物模型中雖然表現(xiàn)出良好的免疫應(yīng)答和免疫保護(hù),但在機(jī)體中,即使它們能誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng),但顯示出很低的免疫原性。1997年,美國(guó)馬里蘭海軍研究中心(NMRC)首次對(duì)登革病毒DNA疫苗進(jìn)行了嘗試。他們將DEN-2的prM和E基因(N端92%,去除C端信號(hào)肽和跨膜序列)克隆至真核表達(dá)載體pVR1012載體構(gòu)建的重組質(zhì)粒,以200μg/只的劑量肌肉注射小鼠,可誘導(dǎo)高水平中和抗體(效價(jià)為1∶320),但未產(chǎn)生免疫保護(hù)。此后,利用同樣的質(zhì)粒系統(tǒng),他們構(gòu)建了含有DEN-1prM和完整E基因的重組pVR1012質(zhì)粒。以1mg/只的劑量分別通過皮下和肌肉途徑接種夜猴,亦可誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平中和抗體,并可顯著縮短病毒血癥的時(shí)間;采用同型DEM感染,可產(chǎn)生免疫記憶應(yīng)答。該研究表明,登革DNA疫苗可誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答和免疫保護(hù),這也是人類首次在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物中進(jìn)行的登革DNA疫苗實(shí)驗(yàn)。日本神戶大學(xué)醫(yī)學(xué)院健康科學(xué)系Konishi等人,構(gòu)建包含4種血清型DEM的prM和E基因的表達(dá)載體的四價(jià)DNA疫苗,免疫BALB/c小鼠,結(jié)果使小鼠產(chǎn)生了記憶性的中和抗體,并對(duì)4種血清型DEM起到免疫保護(hù)。有文獻(xiàn)報(bào)道稱,DEM引起的抗體依賴性增強(qiáng)作用,可能由E蛋白引起。一些以DEM的NS1作為靶標(biāo)構(gòu)建DNA疫苗,也存在許多因素影響登革DNA疫苗的免疫效率,比如細(xì)胞因子、佐劑、劑量等。很多研究針對(duì)提高登革DNA疫苗應(yīng)答水平進(jìn)行探索。當(dāng)中,采用免疫刺激序列和以含有細(xì)胞因子的質(zhì)粒DNA作為佐劑可提高有效刺激重組質(zhì)粒DNA的免疫應(yīng)答水平。但最新研究表明,當(dāng)曾感染過DEM的人,在初次感染后產(chǎn)生的prM-E蛋白抗體會(huì)在異型二次感染再次被激活并發(fā)揮作用,但它們不但無法保護(hù)身體免受二次感染,反而會(huì)幫助病毒進(jìn)行復(fù)制,促使病毒去感染更多的正常細(xì)胞。有關(guān)研究表明,登革DNA疫苗既能誘導(dǎo)體液免疫,也能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫。可目前的研究基本上沒對(duì)登革病毒DNA疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫進(jìn)行深入分析。還有相關(guān)研究表明,盡管針對(duì)prM-E基因的重組誘導(dǎo)的中和抗體水平低,但依然產(chǎn)生部分保護(hù)效果,重組質(zhì)粒誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答在產(chǎn)生免疫保護(hù)中也具有重要的作用。4免疫能力的研究近年來,登革疫苗的研究已取得了可觀的進(jìn)展,四價(jià)減毒活疫苗和四價(jià)DNA疫苗已進(jìn)入或有望進(jìn)行臨床研究,但仍然存在許多問題需要解決,包括DEM感染致病機(jī)制目前尚不清楚,沒找到合適的動(dòng)物模型,DEM毒力大少的決定因素不清楚,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與臨床數(shù)據(jù)的不吻合,除NS1的功能外,DEM其他非結(jié)構(gòu)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能知之甚少等等。這些問題的存在將會(huì)阻礙登革疫苗的研究發(fā)展。而且,必須制定新的策略以確保登革疫苗在后期臨床試驗(yàn)階段的安全可靠性。在機(jī)體被DEM感染后獲