胸段脊髓損傷后神經(jīng)功能評價的最佳方法

胸段脊髓損傷后神經(jīng)功能評價的最佳方法

脊柱損傷（pci）是一種嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)損傷，主要包括核電站損傷和各種組織代謝障礙引起的序列損傷。然而，后者的損傷程度遠(yuǎn)高于前者。目前尚無有效的治愈辦法,然而建立SCI后神經(jīng)功能評定方法是確定SCI程度、觀察恢復(fù)情況及評價藥物療效的基本要求。根據(jù)臨床損傷特點,本實驗利用T10脊髓全離斷法制備急性SCI動物模型,模擬臨床上外傷所致的急性SCI,并采用不同的評估標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較研究,旨在明確哪一種評估標(biāo)準(zhǔn)更符合SCI后的功能狀態(tài),從而探討SCI后神經(jīng)功能的恢復(fù)機制,為臨床治療SCI提供新的實驗依據(jù)。1材料和方法1.1實驗材料成年雌性Sprague-Dawley大鼠,體質(zhì)量180~250g,SPF級,購自蘭州大學(xué)實驗動物中心。1.2實驗方法1.2.1確保運動功能正常實驗前對所選大鼠進(jìn)行常規(guī)行為能力測試,確保其運動功能正常。20只大鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,依次編號隨機分成兩組,脊髓損傷組和假手術(shù)組各10只。1.2.2術(shù)后護(hù)理方法脊髓損傷組:術(shù)前所有動物禁食12h,但自由飲水。全部10只大鼠在椎板切除后,接受T10水平的脊髓離斷。具體方法為:10%水合氯醛(0.35ml/100g,腹腔注射)麻醉滿意后,備皮,大鼠取俯臥位固定于手術(shù)臺上。定位后以T8為中心行后正中切口,切開皮膚,逐層鈍性分離,暴露T8棘突及橫突。用鑷子夾住橫突固定,用微型蚊式鉗咬除T8椎板,暴露脊髓。在顯露的脊髓中間位置橫向剪開硬脊膜和蛛網(wǎng)膜,用顯微手術(shù)刀片尖端在顯露出的脊髓背靜脈和兩側(cè)脊髓背動脈之間橫向切開軟膜,并于軟膜下切除脊髓3~4mm,即刻見大鼠雙下肢抽搐,尾巴甩動,然后完全松弛。鏡下觀察脊髓缺損處無組織殘留,確保完全離斷。切口處以外的軟膜要保持完整,保留脊髓腹、背動靜脈。用冰凍生理鹽水反復(fù)沖洗傷口以減少出血,術(shù)中嚴(yán)格無菌操作。術(shù)畢縫合硬脊膜,逐層關(guān)閉切口,以4-0絲線分別縫合肌層和皮膚,局部噴灑青霉素,無菌敷料包扎。假手術(shù)組:術(shù)前準(zhǔn)備同脊髓損傷組,同法切除T8椎板并顯露硬脊膜,但不離斷T10脊髓,然后依次將皮膚、肌肉縫合,關(guān)閉切口。術(shù)后護(hù)理:SCI模型建立后,應(yīng)暫時提高所處飼養(yǎng)環(huán)境溫度,控制在22℃~25℃之間,并定期通風(fēng);單籠喂養(yǎng),勤換飼養(yǎng)籠墊料,保持干燥,因尿失禁而被浸濕的肢體應(yīng)及時清洗擦干;隔日懸吊鼠尾20~30min,以減輕截癱后肢的受壓;同時配合每天的下肢按摩,促進(jìn)血液循環(huán),保持關(guān)節(jié)的活動度;每天擠壓膀胱協(xié)助排尿2~3次,促進(jìn)大鼠反射性膀胱形成;術(shù)后常規(guī)每日20萬單位青霉素肌注,直到血尿、膿尿停止;皮下注射生理鹽水或葡萄糖液,預(yù)防失血性休克。1.3評估標(biāo)準(zhǔn)1.3.1改進(jìn)的tallingov評估標(biāo)準(zhǔn)1.3.2評估bbb的標(biāo)準(zhǔn)1.4大鼠評分實驗所有大鼠均在術(shù)后1、3、5、7、14、21、28d分別采用改良Tarlov評分和BBB評分,各評分間隔30min進(jìn)行。評分采用雙人雙盲獨立觀察,觀察者為非本組實驗人員,但對評分標(biāo)準(zhǔn)熟悉。因大鼠晝夜活動差別較大,評分均于晚上8點進(jìn)行,觀察期為4min,每只測3次,取其平均值,最后結(jié)果為兩位觀察者的平均記錄分?jǐn)?shù)。評價前所有動物應(yīng)檢查膀胱是否充盈,以免因膀胱充盈而影響活動。1.5評估臨床療效比較先將兩組大鼠按不同評估標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組間比較,再將評分值標(biāo)準(zhǔn)化為百分制后進(jìn)行不同評估標(biāo)準(zhǔn)間的比較。采用統(tǒng)計分析軟件SPSS19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,計量資料以ue0af±s表示,樣本均數(shù)間比較采用t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P<0.01為差異非常顯著。2結(jié)果2.1術(shù)后大鼠術(shù)后情況大鼠SCI后2h基本清醒,假手術(shù)組大鼠后肢關(guān)節(jié)可出現(xiàn)輕微活動,能夠自主飲水。脊髓損傷組大鼠表現(xiàn)為截癱,兩個前肢可爬行運動,但后肢和尾部無活動,雙后肢肌力感覺消失,對針刺亦無反應(yīng),出現(xiàn)尿潴留、大便困難等SCI表現(xiàn),尚無進(jìn)食及進(jìn)水需求。SCI后1d,假手術(shù)組大鼠雙后肢肌力基本恢復(fù)正常,活動增多,后肢協(xié)調(diào)性相對較好,飲食也逐漸恢復(fù)正常。脊髓損傷組大鼠主要靠前肢拖著身體移動,腹部貼地,雙足底向上呈不負(fù)重狀,直到傷后2周,才開始出現(xiàn)后肢運動,但髖膝關(guān)節(jié)及足部諸關(guān)節(jié)均有不同程度僵硬,4周時可見明顯后肢活動,甚至出現(xiàn)協(xié)調(diào)活動,少數(shù)大鼠排尿功能恢復(fù),但仍有膀胱殘余尿。所有大鼠切口均愈合良好,未見明顯感染跡象,縫線在2~3周內(nèi)自行脫落。由于定時更換墊料,大鼠雙后肢未見褥瘡現(xiàn)象,但由于缺乏及時有效的康復(fù)功能訓(xùn)練,部分脊髓損傷組大鼠后肢出現(xiàn)不同程度的肌肉萎縮。在整個實驗過程中,因各種原因(如麻醉意外、咬傷等)而死亡的大鼠共6只(其中假手術(shù)組2只,脊髓損傷組4只),總死亡率為30%。實驗過程中及時補充同批次大鼠,以確保每組動物數(shù)量一致。2.2運動功能評估2.2.1髓傷傷大鼠術(shù)后肌力下降隨著時間的推移,兩組大鼠脊髓功能逐漸恢復(fù),改良Tarlov評分呈升高趨勢。假手術(shù)組大鼠在傷后1d內(nèi)分值輕度減低,第3~14d時分值保持穩(wěn)定,至傷后28d已基本恢復(fù)正常水平。脊髓損傷組大鼠傷后1d是其功能下降最大時期,偶見大鼠后肢活動,上述評分達(dá)最低值,傷后3~5d大鼠后肢肌力逐漸開始恢復(fù),至2周前恢復(fù)幅度較大,但到14~21d時,恢復(fù)程度略有下降,但仍保持增長趨勢,并于傷后28d達(dá)到峰值。改良Tarlov評分顯示傷后各時間點,兩組大鼠分值間的差別非常明顯,具有顯著性差異(P﹤0.01),見圖1。2.2.2不同評分標(biāo)準(zhǔn)之間的一致性假手術(shù)組大鼠術(shù)后未發(fā)現(xiàn)明顯變化,傷后1d出現(xiàn)短暫性活動遲緩,到第3d時,功能基本恢復(fù)正常,此后分值基本保持不變。脊髓損傷組大鼠在傷后1d出現(xiàn)精神萎靡,腹壁貼地,雙后肢處于伸直位,評分僅為3分。BBB分級評定顯示,脊髓損傷組大鼠的運動功能在傷后28d內(nèi)均有不同程度的恢復(fù),但以前2周恢復(fù)較快,尤以傷后7~14d最快,出現(xiàn)明顯增高趨勢。到第21d時,神經(jīng)功能恢復(fù)進(jìn)入緩慢期,評分結(jié)果也趨于平緩。脊髓損傷組與假手術(shù)組相比,SCI后各時間點,假手術(shù)組評分較高,平均約為19.34分,接近正常,而脊髓損傷組BBB得分結(jié)果較假手術(shù)組明顯下降,差異非常顯著(P﹤0.01),見圖2。從結(jié)果可以看出脊髓損傷組分值呈跳躍性分布,恢復(fù)時間越短越能體現(xiàn)出組間差異性。為了便于組內(nèi)不同評分標(biāo)準(zhǔn)之間的橫向比較,將改良Tarlov評分和BBB評分結(jié)果均標(biāo)準(zhǔn)化為百分制,結(jié)果見表1。表內(nèi)數(shù)據(jù)顯示,假手術(shù)組大鼠上述評分在傷后各時間點均無顯著性差異(P﹥0.05),故假手術(shù)組不同評分標(biāo)準(zhǔn)之間的一致性較好。但脊髓損傷組大鼠兩組評分值之間的差異較大,傷后1、3、5、7d評分結(jié)果之間差異非常顯著(P﹤0.01),傷后14d大鼠后肢功能恢復(fù)進(jìn)入緩慢期,兩組評分值之間的差距縮小,無統(tǒng)計學(xué)意義(P﹥0.05)。3討論3.1不同健全的髓橫斷模型建立一個合理、標(biāo)準(zhǔn)的SCI模型是進(jìn)行SCI研究的前提,只有在相同的實驗條件下,才能更好地研究SCI機制,觀察其病理生理改變,從而找出SCI后最佳的治療方案。目前在SCI的實驗研究中,動物模型種類較多,制作方法和適用的研究方向也各不相同。盡管國內(nèi)外已經(jīng)建立了多種SCI動物模型,但不同的模型復(fù)制出不同類型的結(jié)構(gòu)損傷、神經(jīng)功能改變,沒有一種特定的SCI模型能夠完全闡明SCI后功能恢復(fù)的各個方面,目前尚缺乏一致公認(rèn)的創(chuàng)傷性SCI模型。然而比較理想的SCI模型應(yīng)具備臨床相似性、可調(diào)控性、可操作性與可重復(fù)性。SCI大鼠模型經(jīng)常用于臨床研究SCI疾病之中,但因脊髓半橫斷時有自我后肢的恢復(fù)功能,通過觀察發(fā)現(xiàn),即使殘留很少量的下行纖維也能明顯引起功能恢復(fù)。有學(xué)者認(rèn)為,這是由于損傷不完全、殘留纖維所致。同時也有研究顯示,不完全性SCI模型缺乏準(zhǔn)確性,其穩(wěn)定性較差,不能反映特定的病理生理變化,且常難以保證模型的一致性,故其應(yīng)用受到極大限制。到目前為止,對于SCI的研究主要集中在軸突再生上,而使用全橫斷模型可以較好地證明再生軸突的損傷所導(dǎo)致的癱瘓癥狀,直接歸因于脊髓橫斷這種原發(fā)性損傷,并及時確定最有效的治療策略,而且這種模型較接近人類SCI后的病理生理特點及變化規(guī)律,這對研究SCI后神經(jīng)細(xì)胞的病理變化、再生規(guī)律以及探索神經(jīng)保護(hù)策略等有較大幫助。因此,有必要采用此種模型,這對研究早期SCI所致截癱的機制具有十分重要的臨床意義。本實驗所采用的脊髓橫斷模型,鏡下觀察以確保完全離斷,且保留脊髓腹、背動靜脈,以減少因缺血引起的繼發(fā)性損傷。在術(shù)中縫合硬脊膜和蛛網(wǎng)膜,形成閉合性傷口,阻斷周圍組織入侵,從而為脊髓再生提供了良好的外周環(huán)境,利于脊髓斷端的解剖對位。而且通過觀察發(fā)現(xiàn),大鼠出現(xiàn)的癥狀具有連續(xù)性,較好的模擬了SCI后行為學(xué)變化的全過程。綜上,作者認(rèn)為該模型能夠保證脊髓完全橫斷,無組織殘留,且SCI后神經(jīng)功能的變化接近于日常生活中人類的SCI類型,并且SCI效果肯定,重復(fù)性好,非常適合于脊髓損傷的研究。3.2不同評分方法對髓功能損害程度評分值的比較在SCI修復(fù)的研究中,SCI后神經(jīng)功能的正確評價是一項重要內(nèi)容。目前,用于SCI后神經(jīng)功能評價的方法主要包括后肢運動功能評價、脊髓神經(jīng)電生理檢測等方法。但由于實驗動物對檢測應(yīng)答的局限性,且誘發(fā)電位并不能與運動功能的改變完全一致,所以近年來產(chǎn)生了許多SCI后運動功能的行為學(xué)評價方法。通過觀察本實驗結(jié)果,改良Tarlov評分和BBB評分均能反映SCI后大鼠后肢恢復(fù)過程中的行為學(xué)變化,體現(xiàn)SCI恢復(fù)的全過程。假手術(shù)組大鼠傷后短時間內(nèi)上述兩種評分方法輕度降低,有學(xué)者認(rèn)為其原因可能是在椎板切除術(shù)中對脊髓的刺激,術(shù)后局部炎癥水腫影響脊髓血供,從而產(chǎn)生脊髓休克所致。改良Tarlov評分結(jié)果顯示,在傷后各時間點脊髓損傷組與假手術(shù)組之間的差異非常顯著(P<0.01),但此法評分跨度大,呈跳躍性分布,對于神經(jīng)功能恢復(fù)的差異性不明顯,只能用于SCI后損傷程度的初步判定。雖然國外曾有文獻(xiàn)報道,認(rèn)為改良Tarlov評分與SCI程度、神經(jīng)功能恢復(fù)及殘存軸突計數(shù)等相關(guān)性較好。但在實際應(yīng)用中,是在一既定損傷程度的動物模型中,并非是不同程度的損傷,然后觀察數(shù)種干預(yù)措施對SCI后功能恢復(fù)的影響,這就需要采用更為敏感的評估標(biāo)準(zhǔn)。然而BBB評分能夠準(zhǔn)確地反映大鼠后肢運動功能的細(xì)微變化,如尾部上翹、爪的位置等,評分結(jié)果與損傷程度具有一定相關(guān)性,與改良Tarlov評分相比,組間的差異性更為突出,其準(zhǔn)確性明顯高于后者。本實驗在術(shù)后不同時間點對兩組大鼠進(jìn)行BBB評分,結(jié)果顯示脊髓損傷組大鼠在術(shù)后即表現(xiàn)為完全性截癱,這是造模成功的一個重要標(biāo)志。有少數(shù)大鼠在傷后1d分值并不為0,這是由于實驗動物之間存在個體差異。此后,隨著時間的延長,脊髓功能有了不同程度的恢復(fù),評分也隨之相應(yīng)上升。但在傷后14d,脊髓功能進(jìn)入一個平臺期,其恢復(fù)緩慢,這是急性SCI的自然轉(zhuǎn)歸。BBB評分顯示術(shù)后各時間點脊髓功能明顯下降,與假手術(shù)組之間差異非常顯著(P<0.01),說明在整個實驗過程中BBB評分均能較好地區(qū)分損傷對脊髓功能造成的影響,且區(qū)分度并未因損傷后期脊髓功能評分值的升高而有所減弱。原先的相關(guān)實驗局限于同一評分方法內(nèi)的比較,缺乏不同方法之間的比較,本研究通過將兩種評分方法標(biāo)準(zhǔn)化為百分制,從而使其之間可以橫向比較。假手術(shù)組大鼠的改良Tarlov評分和BBB評分顯示術(shù)后各時間點均無顯著性差異(P>0.05),說明不同評分方法所得分值之間的一致性較好。但在脊髓損傷組大鼠可以觀察到術(shù)后各時間點兩組評分值之間的差異性較大,其中術(shù)后1、3、5、7d上述評分結(jié)果之間差異非常顯著(P<0.01),而在術(shù)后14、21、28d兩組評分值之間的差異無顯著性(P>0.05),說明在SCI早期,雖然兩種評分方法均能評估脊髓損傷對其功能產(chǎn)生的影響,但BBB評分更加敏感,并且從不同評分方法所得分值來看,BBB評分所反映的組間差距在術(shù)后各時間點均較改良Tarlov評分明顯,從而在總體上說明BBB評分的區(qū)分度要優(yōu)于改良Tarlov評分。因此作者認(rèn)為,BBB評分能夠準(zhǔn)確反映大鼠SCI后的功能恢復(fù)過程,對大鼠SCI后運動功能評價更具優(yōu)勢,值得在以后的實驗研究中進(jìn)一步推廣。此外,其他應(yīng)用較多的評定方法有聯(lián)合行為評分法(combinedbehavourialscore,CBS)、Rivlin斜板試驗等方法,但其人為主觀性因素較多,所需設(shè)備較復(fù)雜,不利于推廣。通過本實驗