大竹精子發(fā)生和精子超微結(jié)構(gòu)的觀察

大竹精子發(fā)生和精子超微結(jié)構(gòu)的觀察

精子的形態(tài)、運動和收縮方式與精子的過程密切相關(guān)，并有其自身的特點。這不僅是分類的基礎(chǔ)，也是分析不同動物群體之間的親和力的重要依據(jù)。國內(nèi)外已有大量關(guān)于軟體動物雙殼類精子超微結(jié)構(gòu)及其精子發(fā)生的報道。大竹蟶Solengrandis隸屬雙殼綱(Bivalvia),簾蛤目(Veneroida),竹蟶科(Solenidae),竹蟶屬(Solen)。本種個體大、足部肌肉發(fā)達(dá)、味道鮮美、營養(yǎng)豐富,是重要的經(jīng)濟(jì)貝類。迄今為止,人們已對大竹蟶的人工繁殖和育苗技術(shù)進(jìn)行過一些研究,但國內(nèi)外尚未見有關(guān)大竹蟶精子發(fā)生和精子超微結(jié)構(gòu)的研究報道。竹蟶科絕大多數(shù)的種類具有很大的經(jīng)濟(jì)價值,但傳統(tǒng)的分類研究往往根據(jù)外形、殼長與殼高的比例進(jìn)行種的鑒定,從而造成分類的困難和混亂。大竹蟶與長竹蟶Solenstrictus兩者外形相似,如貝殼均較長,前后端開口,殼質(zhì)薄脆;前緣呈截形,后緣近圓形,背、腹緣直且相互平行;殼頂不明顯,位于最前緣。傳統(tǒng)上區(qū)別兩者主要是依據(jù)殼長與殼高的比例,大竹蟶一般殼長約為殼高的4—5倍,而長竹蟶一般殼長約為殼高的6—7倍。本文對大竹蟶精子發(fā)生的演變規(guī)律及其超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了詳細(xì)的觀察,并與同屬的長竹蟶進(jìn)行比較,結(jié)果將有助于探討竹蟶科近似種的分類及親緣關(guān)系,為海洋貝類繁殖生物學(xué)研究及大竹蟶人工育苗提供理論依據(jù)。1透射電鏡觀察材料于2006年5月購自福州市西營里市場,殼長為9.5—10.0cm。選取5只性腺成熟的雄性大竹蟶,迅速解剖,取其精巢組織,3%戊二醛-1.5%多聚甲醛0.1mol·L-1磷酸緩沖液(pH=7.2)于4℃固定2h,充分漂洗,1%鋨酸-1.5%亞鐵氰化鉀液固定1.5h,漂洗,鈾塊染色,乙醇-丙酮梯度脫水,環(huán)氧樹脂618包埋,超薄切片機切片,切片厚70—80nm,分別經(jīng)醋酸鈾、檸檬酸鉛染色,用日立Hu-12A型透射電鏡觀察并拍攝。數(shù)據(jù)測量:選取切面完整、正中的細(xì)胞10—15個,進(jìn)行不同發(fā)育階段細(xì)胞特征的測量。2生殖鞣發(fā)育階段大竹蟶精子的發(fā)生不同步(圖1a)。生殖上皮向管腔中央排列著一群不同發(fā)育階段的生精細(xì)胞:精原細(xì)胞、初級精母細(xì)胞、次級精母細(xì)胞、精細(xì)胞和精子。2.1核質(zhì)的組成精原細(xì)胞是生精細(xì)胞中個體最大的,胞體呈長橢圓形,大小為(7.1—8.5)μm×(5.1—5.9)μm。核內(nèi)異染色質(zhì)呈小塊狀,附在核內(nèi)膜及稀疏分布在核質(zhì)中。細(xì)胞質(zhì)電子密度低,含有一些橢圓形的線粒體。線粒體基質(zhì)電子密度低,嵴稀少似空泡(圖1b)。胞質(zhì)內(nèi)很少內(nèi)質(zhì)網(wǎng),有高爾基體和小的前頂體顆粒。早期精原細(xì)胞經(jīng)一次有絲分裂形成晚期精原細(xì)胞,其明顯變化是異染色質(zhì)塊稍變大,線粒體嵴稍增多增長。晚期精原細(xì)胞常見核分裂為二,而胞質(zhì)未分開的現(xiàn)象,形成雙核細(xì)胞(圖1c)。2.2核質(zhì)內(nèi)異染色質(zhì)塊初級精母細(xì)胞由晚期精原細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來。細(xì)胞近橢圓形,大小為(6.3—7.1)μm×(4.3—4.7)μm。核卵圓形,長徑為4.9—5.4μm,短徑為3.8—4.0μm。核內(nèi)異染色質(zhì)塊增大,附在核內(nèi)膜及不均勻分散在核質(zhì)中,胞質(zhì)電子密度增高。橢圓形線粒體分布在細(xì)胞的一側(cè),體積稍增大,基質(zhì)的電子密度也較前期增高(圖1d)。高爾基體發(fā)育良好(圖1e),由一系列致密平行的扁平囊組成,兩端膨大成泡狀,其周圍分泌有嗜鋨的高爾基囊泡。細(xì)胞質(zhì)中可見少量的前頂體顆粒。2.3細(xì)胞核尺寸和高爾基體初級精母細(xì)胞經(jīng)第1次成熟分裂產(chǎn)生次級精母細(xì)胞,細(xì)胞橢圓形,長徑約5.2—6.2μm,短徑約4.5—5.2μm。細(xì)胞核橢圓形,大小約為(4.4—5.3)μm×(2.7—3.2)μm。細(xì)顆粒狀異染色質(zhì)已凝聚成大的團(tuán)塊,有的團(tuán)塊開始互相融合。線粒體集中分布在細(xì)胞的一側(cè),極性明顯,嵴增多增長,有少量長線狀內(nèi)質(zhì)網(wǎng)彎曲分布在胞質(zhì)中。高爾基體更加發(fā)達(dá),可見一對中心體發(fā)出的軸絲(圖1f)。前頂體顆粒數(shù)量增多,已經(jīng)有一些小顆粒融合形成較大的顆粒(圖1g)。2.4體積、測定精細(xì)胞是次級精母細(xì)胞經(jīng)第2次成熟分裂產(chǎn)生的,體積明顯變小。根據(jù)其發(fā)育過程中染色質(zhì)凝集狀況、前頂體囊及線粒體的形態(tài)位置和變化特征,將其分為4個時期。2.4.1異染色質(zhì)團(tuán)的制備細(xì)胞橢圓形,大小為(3.6—4.5)μm×(2.3—3.1)μm。核較大,核形與胞體一致,大小為(2.5—3.0)μm×(1.8—2.1)μm(圖1h)。異染色質(zhì)團(tuán)塊變大且大部分已聯(lián)結(jié)在一起。線粒體開始融合,數(shù)目減少,體積增大,嵴更加發(fā)達(dá)。同時,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)大量高電子密度的前頂體顆粒逐漸融合,形成圓形的前頂體囊,其電子密度較高且均勻,此時前頂體囊和線粒體位于細(xì)胞核的同一側(cè)。隨著發(fā)育的進(jìn)行,前頂體囊內(nèi)的物質(zhì)開始分化,圖1i顯示精細(xì)胞I期后期形成的前頂體囊,其內(nèi)物質(zhì)分布不均,中間區(qū)域為較低電子密度的絮狀物,高電子密度的物質(zhì)分布在周緣呈一個帶缺口的弧形而不是圓形。2.4.2近圓形高電子密度區(qū)域的分布細(xì)胞核與I期相比逐漸變?yōu)榻鼒A形,長徑約為2.2μm,短徑約為1.8μm,較精細(xì)胞I期小,核內(nèi)顆粒狀染色質(zhì)變粗。線粒體繼續(xù)融合,內(nèi)部基質(zhì)的電子密度增大,嵴增多增長。同時近圓形的前頂體囊從缺口處開始內(nèi)凹,高電子密度物質(zhì)仍分布在周緣(圖2a)。線粒體和中心體開始向核后端移動,內(nèi)凹的前頂體囊則一邊變形一邊向核前端移動(圖2b)。2.4.3密度、大小及其分布細(xì)胞形狀大小與Ⅱ期相似,核變小,較Ⅱ期拉長。細(xì)胞核長徑1.7—2.3μm,短徑1.8μm。異染色質(zhì)顆粒進(jìn)一步增大,密度增高,粗顆粒狀染色質(zhì)完全連為一體。線粒體繼續(xù)融合,基本成形并到達(dá)核后端,近遠(yuǎn)端中心粒移至線粒體間(圖2c)。前頂體囊繼續(xù)內(nèi)凹,且其內(nèi)物質(zhì)均質(zhì)化、密度增大,形成馬鞍形的前頂體,并遷移至核前端(圖2d)。最終前頂體、細(xì)胞核、線粒體三者位于一直線上。前頂體臨核面中央向內(nèi)凹形成亞頂體腔,內(nèi)含低電子密度的物質(zhì)。2.4.4長徑、短徑、長徑生長圖1333精細(xì)胞胞質(zhì)減少,體積縮小,形態(tài)與精子相似。細(xì)胞核進(jìn)一步濃縮變小成子彈形,長徑為1.7—2.0μm,短徑為1.4—1.5μm。核內(nèi)粗顆粒狀染色質(zhì)進(jìn)一步濃縮,成為高電子密度的均質(zhì)物,可見少量核泡。頂體基本形成,細(xì)胞質(zhì)作為遺留物大部分被排棄,僅留一薄層波紋狀的細(xì)胞膜圍繞著精細(xì)胞(圖2e)。2.5克氏原螯蝦精子的結(jié)構(gòu)在透射電鏡下大竹蟶成熟精子為原生型,由頭部、中段和尾部3部分構(gòu)成(圖2f)。頭部由頂體和細(xì)胞核組成,長為2.0—2.2μm。頂體位于頭部最前端,較短,約為核長的五分之一,呈倒置的碗狀,其軸向縱切面觀為馬鞍形,長約0.45μm,最寬處約0.50μm。頂體顆粒為均勻的高電子密度物質(zhì)。亞頂體腔位于頂體中央,幾乎到達(dá)頂體的頂端,內(nèi)含低電子密度的亞頂體物質(zhì)。細(xì)胞核頂端窄而底部寬,外形似子彈頭,長為1.7—1.8μm,頂部最窄處為0.3—0.4μm,底部最寬處為0.7—0.9μm。染色質(zhì)高度濃縮,電子密度高而均勻,可見少量核泡。細(xì)胞核前端未形成核前窩;但核后端有一淺的核后窩,是近端中心粒嵌入細(xì)胞核的部位(圖2g)。精子頭部與質(zhì)膜間往往有少量的細(xì)胞質(zhì),質(zhì)膜呈波紋狀。中段較短,長約0.8μm,最寬處約1.6μm。主要結(jié)構(gòu)由線粒體圍繞中心粒復(fù)合體形成。中段橫切面上可見4或5個橢圓形線粒體圍繞在遠(yuǎn)端中心粒周圍(圖2i和圖2j)。線粒體長徑約為0.8μm,短徑約為0.65μm;嵴發(fā)達(dá)、長而密,清晰可見。線粒體與質(zhì)膜間的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域有明顯的糖原顆粒。中心粒復(fù)合體由相互垂直的近端中心粒和遠(yuǎn)端中心粒組成,橫切面顯示為“9+0”的結(jié)構(gòu)(圖2g),近端中心粒直徑約為0.20μm,遠(yuǎn)端中心粒直徑約為0.20μm,長約為0.28μm。遠(yuǎn)端中心粒后端外圍向四周發(fā)出9條輻射狀電子致密帶形成的衛(wèi)星體結(jié)構(gòu)(圖2k)。尾部細(xì)長,在光學(xué)顯微鏡下測得其長度為50—55μm,由軸絲和質(zhì)膜組成,軸絲由遠(yuǎn)端中心粒發(fā)出,為典型的“9+2”型結(jié)構(gòu),由中央的兩個單根微管和周圍的9個成對微管組成(圖2h)。3小鼠精子的超微結(jié)構(gòu)動物的精子發(fā)生特別是精子結(jié)構(gòu)可以在一定程度上為研究物種間的親緣關(guān)系、系統(tǒng)分類提供有利的證據(jù)。近年來國內(nèi)外不少學(xué)者對軟體動物精子超微結(jié)構(gòu)做了比較研究,如Hodgson等對貽貝科3種動物精子的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較;鄧道貴等比較了雙殼類9種動物精子的超微結(jié)構(gòu);柯才煥等對鮑科雜色鮑Haliotisdiversicolorsupertexta、盤鮑Hdiscusdiscus、皺紋盤鮑H.discushannai精子的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了詳細(xì)比較,都認(rèn)為精子的細(xì)微結(jié)構(gòu)如頂體和核的大小、比例及外形可以作為種間鑒別的依據(jù)。本文主要從以下幾個方面比較大竹蟶與同屬的長竹蟶的精子發(fā)生和精子超微結(jié)構(gòu),以期為利用精子超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行竹蟶科的系統(tǒng)分類提供依據(jù)。3.1高電子密度區(qū)域的分布大竹蟶精子發(fā)生的過程與多數(shù)軟體動物雙殼類一樣,依次經(jīng)歷了精原細(xì)胞、初級精母細(xì)胞、次級精母細(xì)胞、精細(xì)胞和精子幾個階段。軟體動物的頂體形成過程一般由高爾基體分泌的嗜鋨液泡或囊泡(也稱為前頂體顆粒)逐漸融合為前頂體囊,并遷移至核的前端,前頂體囊內(nèi)凹變形,密度不斷增加;最終發(fā)育為前頂體。大竹蟶和長竹蟶的頂體發(fā)育過程基本相似,前頂體囊為近圓形,其內(nèi)物質(zhì)分布不均,周緣呈現(xiàn)高電子密度,中間區(qū)域則呈現(xiàn)較低電子密度。不同的是大竹蟶精細(xì)胞前頂體囊的高電子密度物質(zhì)分布在周緣呈一個帶缺口的弧形而不是圓形,此后前頂體囊正是從此缺口處開始內(nèi)凹;而長竹蟶前頂體囊周緣的高電子密度物質(zhì)呈一圓形分布。多數(shù)雙殼類的前頂體囊是在到達(dá)核前端后才開始變形,而大竹蟶的前頂體囊則是先內(nèi)凹變形,然后一邊變形一邊移動,到達(dá)核前端時前頂體基本形成,這與長竹蟶及其他雙殼類精子頂體的發(fā)育有明顯的不同。但翡翠貽貝Pernaviridis的頂體發(fā)育卻同時存在兩種情形,既有邊移動邊變形的情況,又同時存在先移動后變形的情況。另外,長竹蟶生精細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)活動十分旺盛,從早期精原細(xì)胞一直到次級精母細(xì)胞都可見到發(fā)達(dá)呈長索狀的內(nèi)質(zhì)網(wǎng),至精細(xì)胞早期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)逐漸消失。大竹蟶精子發(fā)生過程中,精母細(xì)胞期和早期精細(xì)胞可見發(fā)達(dá)的高爾基體及分泌的囊泡和明顯的前頂體顆粒,到早期精細(xì)胞時已融合形成圓形的前頂體囊。與長竹蟶不同的是,大竹蟶生精細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的活動不是十分旺盛,在精原細(xì)胞和精母細(xì)胞期很少見到發(fā)達(dá)呈長索狀的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。此外,在精子發(fā)生過程中,大竹蟶精核形態(tài)由長(精母細(xì)胞期)到圓(精細(xì)胞Ⅱ期),繼而又拉長(精細(xì)胞Ⅲ之后),與長竹蟶的精核變化(由長到圓)也是不同的。因此,精細(xì)胞分化的細(xì)節(jié)也是區(qū)別外部形態(tài)相近物種的依據(jù)。3.2兩種精子形態(tài)的比較雙殼類軟體動物精子頂體的有無、頂體的大小與形態(tài)以及亞頂體腔的形態(tài)結(jié)構(gòu)差異可作為探討種間聯(lián)系與親緣關(guān)系的依據(jù)。大竹蟶成熟精子頂體形態(tài)與長竹蟶精子的極為相似,較短,約為核長的五分之一,呈倒置碗狀,軸向縱切面觀呈馬鞍形;其內(nèi)物質(zhì)密度高且分布均勻,亞頂體腔內(nèi)含有均勻的低密度的物質(zhì),但大竹蟶的頂體比長竹蟶的頂體稍長。雙殼類精子頭部另一個重要的結(jié)構(gòu)是細(xì)胞核,種與種之間精核的形態(tài)結(jié)構(gòu)差異主要體現(xiàn)在其大小、橫徑與縱徑的比例、核前窩與核后窩的有無及結(jié)構(gòu)的不同。大竹蟶成熟精子細(xì)胞核頂端窄底部寬,外形似子彈頭,而長竹蟶核呈圓球形;兩者核形差異較大,但都沒有核前窩,而都有淺的核后窩。另外大竹蟶的精核比長竹蟶的稍大、較長,從而進(jìn)一步證實精核形狀和大小是區(qū)分相近物種的重要依據(jù)之一。大竹蟶精子中段由線粒體圍繞近端中心粒與遠(yuǎn)端中心粒組成,線粒體形態(tài)為卵圓形,由內(nèi)外雙層膜包繞,與長竹蟶一樣數(shù)目為4個或者5個。在大竹蟶遠(yuǎn)端中心粒周圍發(fā)現(xiàn)有衛(wèi)星體結(jié)構(gòu)(圖2j),它是由遠(yuǎn)端中心粒后端外圍向四周發(fā)出的9條輻射狀電子致密帶,每條致密帶的末端與質(zhì)膜及線粒體相連,以加強鞭毛與精子頭部的連接。菲律賓蛤仔Ruditapesphilippinarum和Anadaragranosa也有此結(jié)構(gòu)。但在長竹蟶精子超微結(jié)構(gòu)的觀察中未報道衛(wèi)星體結(jié)構(gòu)的存在。大竹蟶尾部鞭毛細(xì)長為50—55μm,明顯較長竹蟶的鞭毛長;與此相應(yīng)兩種蟶精子頭部占精子的比例也有差異:大竹蟶精子全長52—57μm,頭部為2.0—2.2μm;長竹蟶精子全長38—43μm,頭部長約1.8μm。這與柯才煥等在比較研