一氧化氮和內(nèi)皮素1在大鼠腦損傷中的作用

一氧化氮和內(nèi)皮素1在大鼠腦損傷中的作用

臨床上，下肢移植的重建、嚴(yán)重的下肢壓縮和長(zhǎng)期使用止血帶可導(dǎo)致下肢缺氧，引起下肢紅細(xì)胞的形成。上述情況在肢體恢復(fù)血流灌注后,不僅缺血組織出現(xiàn)更嚴(yán)重的損傷,而且可以進(jìn)一步導(dǎo)致遠(yuǎn)隔器官損傷及腦損傷。目前肢體缺血再灌注(limbischemia/reperfusion,LI/R)后的腦損傷已引起有些學(xué)者注意,有關(guān)研究證實(shí),一氧化氮(NO)和內(nèi)皮素-1(ET-1)參與了組織缺血再灌注損傷。我們?cè)诖笫驦I/R損傷模型上,對(duì)NO/ET-1比值的變化與腦損傷的關(guān)系進(jìn)行了初步探討。1材料和方法1.1大鼠肢體活檢健康雄性Wistar大鼠,體重200~250g,河南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物隨機(jī)分成5組(n=8):(1)對(duì)照(Control)組;(2)缺血/再灌組(I/R);(3)L-Arg+I/R組(L-Arg);(4)AG+I/R組(AG);(5)BQ123+I/R組(BQ123)。采用我室常規(guī)方法復(fù)制大鼠肢體缺血/再灌注損傷成功模型,大鼠術(shù)前12h禁食,自由飲水。乙醚淺麻醉下以止血帶環(huán)繞結(jié)扎大鼠雙后肢根部,迅速完全阻斷動(dòng)物后肢動(dòng)靜脈血流,結(jié)扎4h后松開(kāi)止血帶恢復(fù)血流灌注4h,對(duì)照組僅以止血帶松弛環(huán)繞雙后肢。于松扎前20min向腹腔注入1%戊巴比妥鈉溶液(0.4ml/kg)麻醉,左側(cè)頸外靜脈注入1000U/kg肝素抗凝血,L-Arg組、AG組和BQ123組均于松扎前20min經(jīng)頸外靜脈給藥,給藥量分別是L-Arg為150mg/kg、AG為30mg/kg,BQ123為7μg/kg,上述三種藥物均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,藥物溶于生理鹽水(NS)(4ml/kg)進(jìn)行滴注,于60min內(nèi)滴完。對(duì)照組及I/R組僅滴注相同劑量的NS。1.2動(dòng)物血漿及腦氧化物歧化酶活性測(cè)定各組動(dòng)物于松扎后4h自腹主動(dòng)脈放血處死動(dòng)物并收集血液離心(3500r/min,15min)取血漿,分裝在Eppendorf管中,-70℃保存?zhèn)溆?。同時(shí)開(kāi)顱取腦,濾紙吸干水分,-70℃儲(chǔ)藏備用。采用試劑盒測(cè)定各組動(dòng)物血漿NO、ET-1、丙二醛(MDA)、黃嘌呤氧化酶(XOD)、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脫氫酶(LDH)及腦組織tNOS、iNOS、cNOS、NO、ET-1、MDA、XOD、髓過(guò)氧化物酶(MPO)、SOD的變化。NO、MDA、XOD、NOS、MPO、SOD試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。血漿及腦組織中ET-1含量的測(cè)定采用放射免疫法,試劑盒購(gòu)自解放軍總醫(yī)院科技開(kāi)發(fā)中心放免所。LDH采用日本HITACHI7200型全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行測(cè)定,試劑盒購(gòu)自北京中山生物工程高技術(shù)公司。以上均按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。1.3統(tǒng)計(jì)分析數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行One-WayANOVA分析q檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)處理。2結(jié)果2.1l-arg對(duì)sod活性的影響I/R組動(dòng)物血漿MDA、XOD、LDH與對(duì)照組比較均明顯升高(P<0.01),而SOD活性明顯降低(P<0.01)。給予L-Arg后,MDA、XOD、LDH較I/R組降低,SOD活性升高;滴注AG后,MDA、XOD、LDH較I/R組升高,SOD活性降低。給予BQ123后,MDA、XOD、LDH較I/R組降低,而SOD活性升高(表1)。2.2no、no/et-1對(duì)I/R組動(dòng)物血漿NO、ET-1與對(duì)照組比較均明顯升高,而NO/ET-1比值降低(P<0.01)。與I/R組比較,L-Arg組NO、NO/ET-1明顯升高,ET-1降低(P<0.01);AG組NO、NO/ET-1比值降低,ET-1與/R組比較差異無(wú)顯著性(P>0.05);BQl23組NO、NO/ET-1值升高,ET-1明顯降低(表2)。2.3l-arg對(duì)大鼠腦損傷的影響I/R組動(dòng)物腦組織NO、ET-1、MDA、XOD、MPO與對(duì)照組比較均明顯升高,而NO/ET-1比值和SOD值降低(p<0.01)。與I/R組比較,L-Arg組和BQl23組NO、NO/ET-1比值升高,MDA、XOD、MPO降低,SOD值升高,腦損傷減輕;滴注AG后NO、NO/ET-1比值、SOD降低,而MDA、XOD、MPO升高(p<0.05),腦損傷加重(表3)。2.4tos、inos和cnos活性的比較與對(duì)照組比較,I/R組動(dòng)物腦組織tNOS和iNOS明顯升高,而cNOS明顯降低(P<0.01),L-Arg組tNOS、iNOS和cNOS活性與UR組比較差異無(wú)顯著性(P>0.05);滴注AG后,tNOS、iNOS值均明顯低于I/R組(P<0.01),cNOS與I/R組比較差異無(wú)顯著性(P>0.05):BQ123組tNOS、cNOS均高于I/R組(P<0.05),iNOS值與I/R組比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)(表4)。3治療前腦損傷的關(guān)鍵指標(biāo)—討論研究表明,ET與NO的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)于臟器功能的調(diào)節(jié)至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,LI/R后血漿和腦組織中NO、ET-1均明顯增加,但ET-1增加的幅度大于NO,使NO/ET-1比值降低,同時(shí)腦的過(guò)氧化損傷程度增加,自由基清除酶SOD活性降低可能與缺血缺氧使SOD生成不足、清除過(guò)多氧自由基時(shí)的消耗等有關(guān)。為進(jìn)一步說(shuō)明NO、ET-1與腦損傷之間的關(guān)系,我們利用L-Arg、AG和BQl23進(jìn)行干預(yù)。給予L-Arg后,血漿及腦組織中NO水平升高,而ET-1減少。L-Arg組NO/ET-1比值較I/R組明顯升高,腦損傷減輕;而靜脈注射AG后,tNOS和iNOS活性下降,NO生成明顯減少,NO/ET-1比值下降,組織損傷加重;給予BQ123后,ET-1水平明顯下降,NO水平上升,這可能與血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷減輕有關(guān),NO/ET-1比值較I/R組升高,腦損傷減輕,提示NO/ET-1平衡關(guān)系的變化可影響肢體缺血再灌后腦損傷的程度。ET-1是一種強(qiáng)效及長(zhǎng)效的血管收縮肽,對(duì)腦血管具有強(qiáng)大的收縮作用。它主要通過(guò)作用于ETA受體發(fā)揮縮血管作用。BQl23是一種特異性ETA受體阻斷劑。多種因素如缺氧、缺血、炎癥介質(zhì)等均可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞受損,ET-1產(chǎn)生和釋放增多,ET-1又可進(jìn)一步引起缺血組織血管收縮,加重組織缺血缺氧。ET-1可通過(guò)引起胞內(nèi)鈣超載、中性粒細(xì)胞聚集粘附、增加自由基的產(chǎn)生及導(dǎo)致微循環(huán)障礙等途徑引起組織損傷。MPO增多反映中性粒細(xì)胞聚集增強(qiáng),文獻(xiàn)報(bào)道中性粒細(xì)胞聚集、粘附可使微血管阻塞,再灌注時(shí)出現(xiàn)缺血器官的“無(wú)復(fù)流”現(xiàn)象。激活的中性粒細(xì)胞可釋放蛋白酶并產(chǎn)生自由基。氧自由基可以使細(xì)胞膜產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化,使細(xì)胞膜的流動(dòng)性降低和通透性增加,引起血管通透性改變、血腦屏障(bloodbrainbarrier,BBB)功能障礙和神經(jīng)元損害。肢體缺血再灌注后,血管內(nèi)皮細(xì)胞受到刺激使ET-1分泌增多,同時(shí)以NO為代表的EDRF水平也明顯升高。在一氧化氮合酶(Nitricoxidesynthase,NOS)作用下,以分子氧和L-Arg為底物生成NO。NOS分為兩型即結(jié)構(gòu)型(cNOS)和誘導(dǎo)型(iNOS)。cNOS主要存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞中,受鈣離子和鈣調(diào)蛋白的調(diào)控,生理刺激后活化釋放少量NO,具有調(diào)節(jié)血壓、抑制中性粒細(xì)胞聚集、粘附等作用。iNOS主要存在于炎性細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞等,不受鈣離子及鈣調(diào)蛋白調(diào)控。正常生理情況下iNOS少有表達(dá),在內(nèi)皮素、細(xì)胞因子等介導(dǎo)下可產(chǎn)生大量NO,具有清除氧自由基等作用。LI/R后自由基產(chǎn)生增多,而自由基清除能力下降,機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化增強(qiáng),中性粒細(xì)胞在腦部浸潤(rùn),缺血組織血管通透性增大,胞漿酶LDH外溢。給予L-Arg治療后,NOS活性雖無(wú)明顯變化,但NO生成增多,使腦損傷減輕。相反,給予AG后,tNOS、iNOS活性降低,NO產(chǎn)生明顯下降,組織損傷加重。給予BQl23后,NO生成增多,其對(duì)抗ET-1的作用,降低血管的反應(yīng)性維持器官的灌注、抗血小板和