氯化鋰聯(lián)合臍血干細(xì)胞移植對(duì)大鼠脊髓全橫斷損傷的修復(fù)效果

氯化鋰聯(lián)合臍血干細(xì)胞移植對(duì)大鼠脊髓全橫斷損傷的修復(fù)效果

人脈血漿（msbs）是指未經(jīng)血液抑制的非晶態(tài)干燥，不同于未分離的紅細(xì)胞。在不同誘導(dǎo)條件下,臍血MSCs可以跨胚層分化為骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌樣細(xì)胞、肝細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞等,加之無倫理學(xué)等問題,是細(xì)胞移植理想的種子細(xì)胞。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)臍血MSCs移植治療脊髓損傷等神經(jīng)損傷類疾病具有一定的效果,氯化鋰具有良好的抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡和促進(jìn)軸突再生等神經(jīng)保護(hù)作用,體外試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)其能促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞向神經(jīng)元分化,抑制神經(jīng)前體細(xì)胞向星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞分化。我們通過制作大鼠脊髓全橫斷損傷,觀察腹腔注射氯化鋰聯(lián)合臍血干細(xì)胞移植修復(fù)大鼠脊髓損傷的效果并探討其作用機(jī)制,為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1生物級(jí)氯化鋰健康雌性SD大鼠80只(8周齡,體質(zhì)量200±20g,由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供);生物級(jí)氯化鋰(南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)系);胎牛血清(FBS)、DMEM-F12培養(yǎng)基、Brdu(Sigma);手術(shù)顯微鏡、熒光倒置顯微鏡(OLYMPUS,Japan);1μl微量注射器(上海高鴿工貿(mào)有限公司),立體定向儀(北京中西泰安有限公司)。1.2移植n組的患者n80只大鼠隨機(jī)分為4組,每組20只:(1)脊髓全橫斷對(duì)照組(A組,n=20):僅行T9平面脊髓全橫斷,(2)氯化鋰組(B組,n=20):脊髓全橫斷+氯化鋰(腹腔注射85mg/kg,1次/d),(3)細(xì)胞移植組:脊髓全橫斷+hUCB-SCs移植(C組,n=20),(4)氯化鋰+細(xì)胞移植組(D組,n=20):脊髓全橫斷+hUCB-SCs移植+氯化鋰。1.3mscs的純化將采集的臍帶血采用密度梯度分離法制備臍血MSCs。將分離細(xì)胞以1×109/L濃度接種于T-25培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)液成分為DMEM/F12+15%FBS。貼壁法純化,待生長(zhǎng)至80%~90%融合時(shí)采用胰酶消化傳代。取第3代臍血MSCs,采用流式細(xì)胞儀鑒定其CD14,CD34,CD45,CD29,CD90,CD105抗原表型。移植前72h按20μmol/L終濃度加入Brdu標(biāo)記細(xì)胞核,調(diào)整終濃度(6~9)×109/L備用。1.4細(xì)胞移植和藥物注射實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉后俯臥于手術(shù)臺(tái)上,以T9椎體棘突為中心縱行切開背部皮膚及皮下組織,剝離兩側(cè)椎旁肌,暴露并咬除T9棘突及椎板,顯露硬膜。在手術(shù)顯微鏡下,縱行剖開硬脊膜約0.5cm,經(jīng)硬脊膜切口,于硬脊膜下蛛網(wǎng)膜外,將超薄手術(shù)刀片抵在一側(cè)骨壁上,完全劃斷脊髓,包括脊髓背靜脈、兩側(cè)的脊髓背動(dòng)脈和脊髓腹動(dòng)脈,切除脊髓約2mm長(zhǎng)。按照Wang等的方法備取第3代臍血干細(xì)胞,在立體定位儀下用1μl微量注射器行細(xì)胞移植。脊髓斷端距頭側(cè)和尾側(cè)各1mm處分別注射1μl細(xì)胞懸液或PBS液。然后顯微縫合硬脊膜,胸背部筋膜覆蓋背側(cè)硬脊膜,分層縫合切口。待動(dòng)物蘇醒后予以常規(guī)飲食飲水,術(shù)后每天腹腔注射青霉素3萬U/kg×2次,共7d;每天膀胱按壓輔助排尿2次,至排尿反射恢復(fù)(約2周)。1.5觀測(cè)指標(biāo)1.5.1bcb功能評(píng)分所有手術(shù)動(dòng)物分別在術(shù)后1d、3d及每周的最后1天,在固定的、較開放的環(huán)境下,對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠術(shù)后活動(dòng)進(jìn)行拍照、錄像,根據(jù)后肢體位、活動(dòng)方式、活動(dòng)范圍等做BBB功能評(píng)分。BBB評(píng)分是一項(xiàng)針對(duì)大鼠脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。主要參照指標(biāo)是后肢、尾部和下部軀干的活動(dòng)范圍及協(xié)調(diào)性。沒有運(yùn)動(dòng)功能為0分,完全正常為21分?？梢蚤g接反應(yīng)脊髓損傷的恢復(fù)情況。實(shí)驗(yàn)評(píng)分采用雙盲、雙人獨(dú)立評(píng)估,由熟悉BBB評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)的兩位非實(shí)驗(yàn)人員獨(dú)自完成,取兩者評(píng)分結(jié)果的平均值作為最后的BBB評(píng)分結(jié)果,盡量減少評(píng)分誤差。1.5.3熒光金注射治療術(shù)后7周,取C、D兩組剩余10只大鼠,麻醉后沿股外側(cè)肌間隙暴露坐骨神經(jīng),用組織鉗鉗夾挫傷坐骨神經(jīng),避光條件下使用微量注射器在坐骨神經(jīng)挫傷區(qū)多點(diǎn)注射2%熒光金,每側(cè)坐骨神經(jīng)注射0.4μl,注射速度0.1μl/min,每注射位點(diǎn)留針5min。切口內(nèi)撒8萬U的青霉素粉劑,逐層縫合切口,術(shù)后正常飼養(yǎng)。1周后同上法取材,置于30%蔗糖中4℃冰箱過夜保存;次日于-18℃以O(shè)CT冰凍切片包埋劑包埋后作20μm厚橫斷面及冠狀面冰凍切片。每組每只動(dòng)物取5張切片,熒光顯微鏡下觀察熒光金標(biāo)記細(xì)胞的分布情況。1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用重復(fù)測(cè)量方差分析,組間多重比較使用LSD-t檢驗(yàn),采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1組大鼠術(shù)后運(yùn)動(dòng)功能情況術(shù)前所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雙后肢BBB評(píng)分均為21分。造模術(shù)后所有動(dòng)物均呈現(xiàn)雙后肢癱瘓,所有大鼠切口均愈合良好,無感染,縫線在3周后脫落。共有4只大鼠死亡(對(duì)照組:于第l、2周各死亡1只;氯化鋰組:于第1、3周各死亡1只;死因均為血尿或膀胱破裂)。術(shù)后3d內(nèi)BBB評(píng)分均為0分。術(shù)后第2周,4組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)均出現(xiàn)不同程度的恢復(fù)。術(shù)后第3周,各組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)較快,其中D組明顯優(yōu)于C組,開始出現(xiàn)后肢部分承重,并且后肢爪的功能出現(xiàn)不同程度的恢復(fù),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后6周,C、D兩組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)進(jìn)入平臺(tái)期。8周末,D組大鼠前后肢步態(tài)協(xié)調(diào)有規(guī)律,腳掌呈負(fù)重位,但無法支撐軀體抬離桌面;C組前后肢步態(tài)協(xié)調(diào)欠佳;A組和B組動(dòng)物BBB評(píng)分均未超過5分,兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表1)。2.2術(shù)后8周熒光顯微鏡下hucb-scs的存存期Brdu標(biāo)記hUCB-SCs的細(xì)胞核,當(dāng)標(biāo)記hUCB-SCs凋亡時(shí),細(xì)胞核溶解、碎裂被巨噬細(xì)胞清除,不顯示黃綠色熒光。術(shù)后8周熒光顯微鏡下見仍有大量移植hUCB-SCs存活,標(biāo)記hUCB-SCs由注射點(diǎn)向遠(yuǎn)處遷移,分布于整個(gè)脊髓損傷區(qū)。其中氯化鋰+細(xì)胞移植組標(biāo)記細(xì)胞存活數(shù)量明顯多于細(xì)胞移植組(圖1)。2.3細(xì)胞移植組與fg氯化鋰+細(xì)胞移植組脊髓損傷區(qū)頭側(cè)中可見少量被FG標(biāo)記的錐體細(xì)胞及軸突發(fā)出金黃色熒光,單純細(xì)胞移植組偶見FG標(biāo)記的錐體細(xì)胞和軸突,脊髓損傷區(qū)頭側(cè)錐體細(xì)胞被FG標(biāo)記,間接證明聯(lián)合移植組和細(xì)胞移植組有連續(xù)性再生軸突穿越損傷區(qū),并與頭端神經(jīng)纖維建立了聯(lián)系(圖2)。3細(xì)胞移植對(duì)髓內(nèi)神經(jīng)纖維的影響UCB-SCs不僅能在體外分化為神經(jīng)細(xì)胞,在體內(nèi)受損的神經(jīng)系統(tǒng)中,在微環(huán)境的合適刺激下,也能夠向神經(jīng)細(xì)胞分化并能整合到神經(jīng)系統(tǒng)中。氯化鋰能顯著促進(jìn)體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)前體細(xì)胞增殖并促進(jìn)其分化為神經(jīng)元。鋰鹽能體內(nèi)促進(jìn)海馬的神經(jīng)發(fā)生。Yick等發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用氯化鋰和糖原合成酶激酶可以增加軸突42%的再生能力。氯化鋰能促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞向神經(jīng)元分化,抑制神經(jīng)前體細(xì)胞向星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞分化,并能減少神經(jīng)前體細(xì)胞移植入大鼠脊髓后小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活化,認(rèn)為能減少宿主免疫反應(yīng)。本研究采用的大鼠脊髓全橫斷模型基本保持了脊髓損傷的一致性,保證了脊髓組織完全橫斷,給臍血干細(xì)胞移植提供了空間。目前,細(xì)胞移植的方法主要有局部定點(diǎn)注射、靜脈注射等,我們采用微量注射器局部注射細(xì)胞懸液的方法,使移植細(xì)胞直接在脊髓缺損處存活增殖和分化,有利于較快的填補(bǔ)缺失的脊髓神經(jīng)細(xì)胞,橋接脊髓損傷的斷端,有利于建立有功能的突觸聯(lián)系,同時(shí)可以避免靜脈注射導(dǎo)致移植細(xì)胞向其他組織器官流失的缺陷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,細(xì)胞移植8周后,在損傷脊髓節(jié)段仍可檢測(cè)到Brdu陽(yáng)性細(xì)胞,表明移植后的臍血干細(xì)胞可以較長(zhǎng)時(shí)間地在脊髓損傷部位存活和遷移。后肢運(yùn)動(dòng)功能BBB評(píng)分結(jié)果顯示,脊髓損傷后48h至細(xì)胞移植后1周,各組動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)功能均無明顯恢復(fù),從移植后2周開始各組均進(jìn)入恢復(fù)期,且氯化鋰聯(lián)合細(xì)胞移植組的恢復(fù)程度明顯優(yōu)于細(xì)胞移植組,表明氯化鋰促進(jìn)細(xì)胞移植對(duì)脊髓損傷大鼠的后肢運(yùn)動(dòng)功能改善。同時(shí),術(shù)后8周脊髓損傷處可見Brdu標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞,熒光金逆標(biāo)示蹤顯示,氯化鋰+細(xì)胞移植組8周時(shí),可見損傷處少量的軸突運(yùn)輸,表明脊髓損傷處有新的再生神經(jīng)纖維通過,才能重建軸漿在神經(jīng)纖維內(nèi)上下運(yùn)輸功能。以上結(jié)果均說明移植的細(xì)胞可以在宿體內(nèi)存活、遷移形成新生的神經(jīng)纖維。而聯(lián)合腹腔注