肥大細(xì)胞在大鼠胰腺組織纖維化形成中的作用及機制

肥大細(xì)胞在大鼠胰腺組織纖維化形成中的作用及機制

胰腺纖維素是由于各種原因引起的慢性胰腺的共同特征，是其病史的一個重要階段。其中胰腺星狀細(xì)胞(PSC)占據(jù)重要地位。最近已證實,肥大細(xì)胞在腎臟間質(zhì)纖維化、心力衰竭、肝臟纖維化、肺臟纖維化、腹膜粘連、傷口愈合、炎癥性腸病等疾病的發(fā)生和發(fā)展中起有重要作用。肥大細(xì)胞釋放的胃食糜酶可刺激間隙成纖維細(xì)胞生長,上調(diào)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成及誘導(dǎo)炎性細(xì)胞趨化和浸潤,參與組織纖維化的發(fā)生和發(fā)展。而且胃食糜酶在血管緊張素Ⅱ(ANGⅡ)的產(chǎn)生,尤其是局部組織ANGⅡ形成中起重要作用。ANGIⅡ是腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)中最主要的活性物質(zhì)。最近研究發(fā)現(xiàn),胰腺組織也存在局部組織RAS,并參與胰腺組織生理和病理調(diào)節(jié)過程。本研究旨在探討胰腺組織肥大細(xì)胞、ANCⅡ與PSC的關(guān)系,從而研究肥大細(xì)胞在胰腺纖維化中的作用和機制。大鼠胰腺組織amesimb檢測1.實驗動物和材料:雄性SD大鼠,體重160～180g,購自上海必凱實驗動物中心。實驗前于本院動物實驗中心飼養(yǎng)2周,常規(guī)飼料及飲水,晝夜交替12h,環(huán)境溫度,濕度適宜,飼養(yǎng)環(huán)境為清潔級。三硝基苯磺酸(TNBS)、色甘酸鈉和48/80復(fù)合物均購自Sigma公司;Trizol試劑、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自Gibco公司;羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶(HRP)、羊抗小鼠IgG-HRP購自AntibodyDignostica公司;兔抗大鼠AT1、AT2多克隆抗體、兔抗大鼠轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)β1、小鼠抗大鼠α-平滑肌肌動蛋白(SMA)多克隆抗體、羊抗兔IgG-HRP購自SantaCruz公司。2.動物模型和分組干預(yù):雄性SD大鼠120只,術(shù)前禁食不禁水12h,1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,劑量為3ml/kg體重,經(jīng)逆行膽胰管注射2%TNBS誘導(dǎo)建立大鼠慢性胰腺炎模型。隨機分為三組:色甘酸鈉組、48/80復(fù)合物組和對照組。上述各組分別于制模后當(dāng)天開始每天給予色甘酸鈉10mg/kg、48/80復(fù)合物500μg/kg或等容積生理鹽水進(jìn)行不同的干預(yù)。每組各40只大鼠,于制模后第3天、1、2、3和4周(每時點8只)分別予大鼠麻醉后剖腹,取胰腺組織,部分胰腺組織用10%中性甲醛固定,部分胰腺組織用液氮凍存。3.胰腺組織病理學(xué)分析、膠原纖維染色、肥大細(xì)胞染色、計數(shù):甲醛固定的胰腺組織標(biāo)本石蠟包埋、3μm連續(xù)切片,行H-E染色,并在光鏡下觀察分析。應(yīng)用改良VanGieson膠原纖維染色法觀察胰腺組織纖維化。應(yīng)用KS400圖像分析系統(tǒng)對胰腺組織膠原纖維染色半定量,采用KS4002.0軟件系統(tǒng)計算。采用硫堇藍(lán)(toluidineblue)染色光鏡下觀察肥大細(xì)胞的分布和脫顆粒情況。隨機選取10個不同區(qū)域,分別計數(shù)單位面積中肥大細(xì)胞數(shù)量。4.免疫組化染色:應(yīng)用PAP兩步法檢測胰腺組織α-SMA、TGFβ1的表達(dá)并觀察其分布。5.逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR):研究胰腺組織ANGⅡAT1、AT2受體mRNA表達(dá)。6.統(tǒng)計學(xué)分析:計量資料用表示。應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件對組間數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析齊性檢驗,方差相齊時進(jìn)行方差分析(ANOVA)或非參數(shù)統(tǒng)計,配對數(shù)據(jù)采用t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。大鼠胰腺組織肥大細(xì)胞數(shù)量及免疫組織at1、tgf1的表達(dá)變化1.胰腺組織病理形態(tài)學(xué)變化:光鏡下觀察H-E染色及胰腺纖維化組織學(xué)評分發(fā)現(xiàn),各組早期(3d、1周)胰腺組織表現(xiàn)主要以炎性細(xì)胞浸潤、間質(zhì)水腫、腺泡細(xì)胞脂肪變性、片狀壞死為主,炎性細(xì)胞以中性粒細(xì)胞為主。但色甘酸鈉組的炎癥較48/80復(fù)合物組和對照組程度輕微。各組均無纖維化。隨著制模時間延長(2、3周),淋巴細(xì)胞增加,中性粒細(xì)胞減少,并出現(xiàn)慢性肉芽腫、嗜酸粒細(xì)胞聚集;胰腺水腫逐漸減輕;腺泡細(xì)胞壞死萎縮逐漸增加,并出現(xiàn)假性導(dǎo)管。胰腺組織纖維化逐漸明顯。上述表現(xiàn)于4周時最明顯,而對照組和48/80復(fù)合物組上述表現(xiàn)明顯重于色甘酸鈉組。各組肥大細(xì)胞硫堇藍(lán)染色均可見明顯肥大細(xì)胞染色陽性。但色甘酸鈉組肥大細(xì)胞數(shù)量明顯少于對照組和48/80復(fù)合物組。各組改良VanGieson染色在纖維化區(qū)域均可見明顯膠原纖維染色陽性,而對照組和48/80復(fù)合物組膠原纖維陽性較色甘酸鈉組明顯。膠原纖維染色圖像掃描分析結(jié)果顯示,對照組胰管周圍和小葉間膠原纖維陽性染色所占面積在術(shù)后第3周為10%±4%,于第4周最強為42%±8%。術(shù)后第4周,色甘酸鈉組胰管周圍和小葉間膠原纖維陽性染色所占面積為25%±8%,48/80復(fù)合物組為56%±12%。2.胰腺組織肥大細(xì)胞數(shù)量、分布及活化情況:早期(3d、1周)硫堇藍(lán)染色陽性肥大細(xì)胞數(shù)量各組均較少(P>0.05)。隨著制模時間的延長,各組均可見肥大細(xì)胞數(shù)量逐漸增加,至4周時達(dá)高峰。與對照組比較,48/80復(fù)合物組數(shù)量較多(P<0.05),但色甘酸鈉組數(shù)量較少(P<0.01)。48/80復(fù)合物組和對照組肥大細(xì)胞數(shù)量和纖維化之間存在明顯相關(guān)性:分別為γ=0.81(P<0.01)和γ=0.75(P<0.01)。見表1。3d時肥大細(xì)胞僅分布在血管和(或)胰管周圍結(jié)締組織中,可見脫顆?，F(xiàn)象。肥大細(xì)胞數(shù)量1周時較3d時減少,少見脫顆?，F(xiàn)象。2周后肥大細(xì)胞數(shù)量開始增加并活化,表現(xiàn)為脫顆粒,并與成纖維細(xì)胞密切接觸。主要分布于壞死纖維化區(qū)域。4周時達(dá)高峰。與對照組比較,48/80復(fù)合物組肥大細(xì)胞數(shù)量增加和活化明顯,主要分布于壞死纖維化區(qū)域;色甘酸鈉組肥大細(xì)胞數(shù)量及脫顆?，F(xiàn)象少于對照組。3.免疫組化染色觀察胰腺組織α-SMA、TGFβ1,蛋白表達(dá)的變化:各組第3天時可見胰腺組織α-SMA、TGFβ1,蛋白表達(dá)陽性,并隨時間延長,上述各項指標(biāo)陽性表達(dá)逐漸增強,至第4周時最強。α-SMA蛋白第3天時陽性表達(dá)見于胰腺腺泡周圍間質(zhì)細(xì)胞,第4周時其陽性染色廣泛分布于血管壁及萎縮的胰腺腺泡周圍間質(zhì)中;TGFβ1,蛋白陽性表達(dá)第3天時主要分布于間質(zhì)細(xì)胞,第4周時分布于間質(zhì)細(xì)胞、炎性細(xì)胞和部分胰腺腺泡細(xì)胞。與對照組比較,48/80復(fù)合物組大鼠胰腺組織α-SMA、TGFβ1蛋白陽性表達(dá)均有不同程度增加。而色甘酸鈉組上述蛋白陽性表達(dá)均有不同程度減少。見圖1。4.RT-PCR觀察胰腺組織AT1、及AT2受體mRNA的表達(dá):對照組大鼠胰腺組織AT1及AT2受體mRNA表達(dá)呈進(jìn)行性增加。與對照組比較,48/80復(fù)合物組大鼠胰腺組織AT1及AT2受體mRNA陽性表達(dá)均有不同程度增加。而色甘酸鈉組兩種蛋白陽性表達(dá)均有不同程度的減少。見圖2。本研究中,與對照組比較,色甘酸鈉組胰腺組織肥大細(xì)胞明顯減少,同時炎癥和纖維化減輕,而48/80復(fù)合物組大鼠胰腺組織肥大細(xì)胞明顯增加,胰腺組織炎癥和纖維化加重。究其原因除色甘酸鈉穩(wěn)定肥大細(xì)胞外,它還抑制肥大細(xì)胞的分化和增殖。色甘酸鈉可抑制T細(xì)胞增殖、胞質(zhì)產(chǎn)生及與細(xì)胞外成分連接和移動。在硬皮病和肝硬化等慢性炎癥和纖維化發(fā)生時,肥大細(xì)胞數(shù)量增加明顯,也同樣存在肥大細(xì)胞動力學(xué)變化。肥大細(xì)胞在慢性胰腺炎過程中的動力學(xué)變化,證實肥大細(xì)胞參與大鼠慢性胰腺炎胰腺纖維化的發(fā)生和發(fā)展。在胰管內(nèi)注射2%TNBS誘導(dǎo)大鼠慢性胰腺炎胰腺纖維化形成過程中,PSC活化具有重要作用。而α-SMA是PSC活化的重要標(biāo)志。色甘酸鈉組大鼠胰腺組織α-SMA表達(dá)量較對照組各時點均減少,提示色甘酸鈉可通過穩(wěn)定肥大細(xì)胞而抑制PSC的活化和增殖;48/80復(fù)合物組大鼠胰腺組織α-SMA表達(dá)量較對照組各時點均增加,提示48/80復(fù)合物可通過活化肥大細(xì)胞而促進(jìn)PSC的活化和增殖。肥大細(xì)胞激活導(dǎo)致脫顆粒釋放多種生物活性介質(zhì),其中包括具有免疫調(diào)節(jié)及促炎作用的細(xì)胞因子如TGFβ1,等,藉此參與多種疾病的發(fā)生。在TNBS誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎模型中,肥大細(xì)胞促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖,增加膠原合成和收縮活性,從而參與該模型胃腸道炎癥和纖維化的發(fā)展。本研究中對照組和肥大細(xì)胞激動劑48/80復(fù)合物組TGFβ1mRNA和蛋白表達(dá)增加,而肥大細(xì)胞膜穩(wěn)定劑色甘酸鈉組其表達(dá)降低。而TGFβ1可通過旁分泌和自分泌方式激活PSC,是胰腺纖維化細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)解中最重要的促纖維化因子。因此,色甘酸鈉可通過穩(wěn)定肥大細(xì)胞,降低其活化,下調(diào)生物活性因子TGFβ1等的表達(dá),進(jìn)而抑制PSC活化。與對照組比較,AT1和AT2受體mRNA和蛋白在48/80復(fù)合物組其陽性表達(dá)增強,而色甘酸鈉組中則減弱。而ANGⅡ是通過與其受體結(jié)合繼而激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮其生理病理調(diào)節(jié)作用。首先,ANGⅡ作為一種促炎因子,可增加血管通透性,并介導(dǎo)炎癥因子、趨化因子等炎癥相關(guān)因子的表達(dá)。其次,ANGⅡ是一種促纖維化因子,它可通過“ANGⅡ-TGFβ1-ECM”調(diào)節(jié)軸調(diào)控間質(zhì)細(xì)胞分化、增殖及ECM代謝,從而促進(jìn)纖維組織過度沉積,導(dǎo)致纖維化的發(fā)生和發(fā)展。肥大細(xì)胞活化后上調(diào)TGFβ1,ANGⅡAT1和AT2受體表達(dá),提示肥大細(xì)胞可通過ANGβAT1和AT2受體發(fā)揮ANGⅡ作為促炎因子和“ANGⅡ-TGFβ1-ECM”調(diào)節(jié)軸促纖維化的作用?？傊?色甘酸鈉通過穩(wěn)定肥大細(xì)胞,降低其活化,下調(diào)生物活性因子TGFβ1等的表達(dá),進(jìn)而抑制PSC活化及其促纖維化作用;而48/80復(fù)合物可通過活化肥大細(xì)胞而上調(diào)TGFβ1表達(dá),促進(jìn)PSC活化、增殖,促進(jìn)纖維化的發(fā)生和發(fā)