靈芝多糖對順鉑致嘔吐的抑制作用

靈芝多糖對順鉑致嘔吐的抑制作用

化療是治療腫瘤的首選方法之一。然而，鉬和其他化療藥物通常會導(dǎo)致惡心嘔吐和其他副作用，導(dǎo)致患者遭受巨大的痛苦，甚至導(dǎo)致許多并發(fā)癥，如脫水、代謝紊亂和營養(yǎng)不良等。治療方案無法順利實施，治療效果也難以影響。目前臨床應(yīng)用的5-HT3受體拮抗劑如恩丹西酮(ondansetron)、格拉司瓊(granisetron)等雖有不錯的止吐效果,但其價格昂貴、對遲發(fā)性嘔吐效果不佳以及對其安全性的擔(dān)憂等尚不能盡如人意;用中醫(yī)藥防治化療所致惡心嘔吐的研究也取得了較好的進展,但也存在起效慢,特異性不強等不足,且臨床觀察居多,機理探討較少。因此,尋找一種特異性強、安全且能有效防治化療所致惡心嘔吐的藥物,并探討其作用機制很有必要。靈芝自古以來就是我國的名貴藥用真菌,可扶正固本,補益全身五臟之氣(周昌艷等2004),素有“仙草”、“瑞草”之譽。近來的研究表明,靈芝提取物(為靈芝多糖、三萜類化合物、蛋白質(zhì)等的混合物)與化療藥物順鉑聯(lián)用,能有效減輕化療藥物順鉑引起的大鼠異食癖(一種公認(rèn)的惡心、嘔吐動物模型)行為(Wangetal.2005)。人體實驗表明,每天口服靈芝提取物2次,每次2g,連續(xù)服用10d后,其心電圖、血細胞計數(shù)、血液和尿液的化學(xué)成分等與服用安慰劑的對照組相比均無顯著差異(Wicksetal.2007),說明靈芝具有較高的安全性。靈芝多糖是靈芝提取物的重要組分,具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤以及保護細胞免受自由基損傷等作用(Liu&Wang2006;Bohetal.2007),但是否具有抑制順鉑所致惡心、嘔吐的效果及其作用機制如何尚不清楚。本研究以小鼠為實驗對象,研究靈芝多糖對順鉑所致高嶺土攝取行為及腦內(nèi)Fos蛋白表達影響。1材料和方法1.1實驗動物雄性昆明小鼠30只,體重30-40g,由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供(許可證號:SCXK冀20031003)。1.2試劑與試劑盒靈芝多糖粗提物(河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究室),順鉑(齊魯制藥有限公司),高嶺土(天津市福晨化學(xué)試劑廠),阿拉伯樹膠粉(天津市博迪化工有限公司),鹽酸格拉司瓊注射液(北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司),兔抗鼠c-fos抗體(SantaCtuz),SP試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司),DAB(博士德生物工程有限公司)。1.3行為檢測方法1.3.1高雄花的準(zhǔn)備按照50:1的比例,將高嶺土和阿拉伯樹膠粉混勻后加入蒸餾水,制成與鼠糧相似的形狀,烘干。1.3.2鹽酸拉德司瓊、順鉑、感官多糖濃度鹽酸格拉司瓊、靈芝多糖和順鉑均用生理鹽水配制,鹽酸格拉司瓊的濃度為2mg/100mL,順鉑濃度為20mg/100mL,靈芝多糖濃度為1g/100mL。1.3.3小鼠的分組和注射購入的小鼠分單籠適應(yīng)飼養(yǎng)3d,其間可自由飲水,并給以足量鼠糧和高嶺土。從第4d開始,將小鼠分為5組:生理鹽水+生理鹽水組,格拉司瓊+順鉑組,生理鹽水+順鉑組,多糖+生理鹽水組,多糖+順鉑組。每日分2次向小鼠腹腔內(nèi)注射生理鹽水或藥物,2次注射的間隔為30min,連續(xù)注射5d,每隔24h稱量1次每只小鼠的鼠糧和高嶺土攝食量。各組動物的處理方法見表1。1.4fos蛋白免疫組化1.4.1腦片準(zhǔn)備依照耿丹丹等(2006)的方法,在最后一次腹腔注射后1.5h,將小鼠灌流取腦。在滑動冰凍切片機上作冠狀連續(xù)切片,切片厚20μm。1.4.3動物腦立體定位圖譜在系統(tǒng)觀察的基礎(chǔ)上,著重觀察免疫陽性反應(yīng)產(chǎn)物較多且與內(nèi)臟反應(yīng)相關(guān)的腦核團:下丘腦室旁核(paraventricularhypothalamicnucleus,PVN)、弓狀核(arcuatenucleus,Arc)、外側(cè)巨細胞旁核(lateralparagigantocellularnucleus,LPGi)、最后區(qū)(areapostrema,AP)、孤束核內(nèi)側(cè)亞核(nucleusofthesolitarytract,medialpart,SolM)、前庭內(nèi)側(cè)核(medialvestibularnucleus,MVe)、前庭下核(spinalvestibularnucleus,SpVe)、藍斑(locusceruleus,LC)、臂旁核(parabrachialnucleus,PBN)。每只鼠的每個核團選取4張切片,參照小鼠腦立體定位圖譜盡量使不同動物的相應(yīng)切片處于同一平面,以保證所得數(shù)據(jù)的可比性。切片用圖像采集系統(tǒng)拍照,在4080×3072像素下計數(shù)各核團固定面積內(nèi)(PBN為741×753μm,AP為741×541μm,LC為493×461μm,Arc為393×353μm,PVN為421×473μm,LPGi為541×549μm,SolM為517×477μm、SpVe和MVe為1269×665μm)的Fos樣免疫反應(yīng)(Fos-likeimmunoreactivity,FLI)神經(jīng)元數(shù)。1.4.4fli神經(jīng)元計數(shù)及統(tǒng)計分析根據(jù)小鼠對高嶺土和鼠糧的攝取量,計算出各組動物高嶺土攝取量占鼠糧攝取量的百分比;將FLI神經(jīng)元的實際數(shù)目換算為FLI神經(jīng)元數(shù)/mm2。求得的數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(M±SD)表示,并用STAT軟件進行統(tǒng)計分析。各組間差異采用單因素方差分析,樣本均數(shù)間的多重比較采用Newman-Keuls檢驗。2結(jié)果與分析2.1土相對攝取量生理鹽水+生理鹽水組和多糖+生理鹽水組相比,從第1d到第3d高嶺土相對攝取量均無差別,且與適應(yīng)飼養(yǎng)期間基本一致,在第4d生理鹽水+生理鹽水組的高嶺土相對攝取量多于多糖+生理鹽水組,差異有顯著性(P<0.05)。生理鹽水+順鉑組的高嶺土相對攝取量在第1d多于其它4組,差異有顯著性(P<0.01);第2d與格拉司瓊+順鉑組之間無明顯差異,但仍高于其它3組(P<0.05或P<0.01)。多糖+順鉑組與格拉司瓊+順鉑組相比,前者的高嶺土相對攝取量少于后者,其中第1d其差異有顯著性(P<0.05),第2-4d的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。多糖+順鉑組與生理鹽水+生理鹽水組相比,前者的高嶺土相對攝取量在4d內(nèi)均多于后者,但第1-2d其差異有顯著性(P<0.05),第3-4d的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。多糖+順鉑組與多糖+生理鹽水組相比,前者的高嶺土相對攝取量在4d內(nèi)均多于后者,但是,在第1d和第3d兩組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),第2d和第4d有顯著性差異(P<0.05)。各組高嶺土相對攝取量的變化及其統(tǒng)計分析結(jié)果見表2。2.2不同核團中fli神經(jīng)元計數(shù)的比較表1本實驗著重對PBN、AP、LC、SolM、Arc、PVN、LPGi和Mve-SpVe等8個核團內(nèi)的FLI神經(jīng)元數(shù)進行了比較。不同處理組各核團內(nèi)的FLI神經(jīng)元數(shù)的統(tǒng)計分析結(jié)果見表3。方差分析結(jié)果顯示,不同處理組間這8個核團內(nèi)FLI神經(jīng)元數(shù)目均存在顯著性差異。生理鹽水+順鉑組各個核團內(nèi)的FLI神經(jīng)元數(shù)最多,且與其它各組間的差異有顯著性(P<0.01);在靈芝多糖+順鉑組,除SolM外其它核團內(nèi)FLI神經(jīng)元數(shù)目均少于生理鹽水+順鉑組,差異有顯著性(P<0.01)。多糖+生理鹽水組與生理鹽水+生理鹽水組相比,Arc和PVN內(nèi)的FLI神經(jīng)元數(shù)沒有差別;在其它核團內(nèi)的FLI神經(jīng)元數(shù),多糖+生理鹽水組多于生理鹽水+生理鹽水組(P<0.05或P<0.01);多糖+順鉑組和格拉司瓊+順鉑組相比,在PBN、AP、Arc、LPGi內(nèi)的FLI神經(jīng)元數(shù)沒有顯著性差異(P>0.05),多糖+順鉑組LC、SolM、PVN和MVe-SpVe內(nèi)FLI神經(jīng)元數(shù)多于格拉司瓊+順鉑組(P<0.05或P<0.01)。圖1顯示了不同處理小鼠PBN內(nèi)的FLI神經(jīng)元分布,以生理鹽水+生理鹽水組(A)、多糖+生理鹽水組(B)的Fos蛋白表達量最少,生理鹽水+順鉑組(C)的Fos蛋白表達量最多,多糖+順鉑組(D)與格拉司瓊+順鉑組(E)的Fos蛋白表達量基本相當(dāng)。3基于順鉑/感官聯(lián)合順鉑5-ht3受體抗劑的抗氧化效力研究惡心(nausea)是一種內(nèi)臟不舒適的感覺,最終以嘔吐(vomiting)達到高潮。嚙齒類動物缺乏嘔吐反射,但在受到放射線照射、旋轉(zhuǎn)、催吐劑等能引起嘔吐的刺激時,表現(xiàn)出攝取高嶺土的異食癖(pica)行為,因而將該異食癖行為視為惡心嘔吐反應(yīng)的表現(xiàn),并將減少高嶺土攝取作為篩選抗嘔吐藥物的一種公認(rèn)的重要指標(biāo)(Yamamotoetal.2002)。本實驗中,在注射順鉑前30min,預(yù)先注射靈芝多糖溶液的小鼠,高嶺土相對攝取量顯著少于生理鹽水+順鉑組,甚至略低于格拉司瓊+順鉑組,說明靈芝多糖對于順鉑所致嘔吐作用的抑制效果,與格拉司瓊相當(dāng)甚至略好。一般認(rèn)為,順鉑的致嘔吐作用與其引起胃腸粘膜和腦內(nèi)某些區(qū)域(如最后區(qū))5-HT的釋放有直接關(guān)系。5-HT作用于迷走神經(jīng)傳入神經(jīng)纖維上的相應(yīng)受體,使迷走神經(jīng)傳入沖動增加,也可直接作用于腦內(nèi)的5-HT3受體,二者共同作用引起惡心等內(nèi)臟不適感覺和嘔吐反應(yīng)。格拉司瓊等5-HT3受體拮抗劑可通過阻斷外周和中樞的5-HT3受體發(fā)揮止嘔吐作用。順鉑導(dǎo)致5-HT釋放的機制還不十分清楚,對胃腸粘膜特別是對能產(chǎn)生5-HT的腸嗜鉻細胞的氧化損傷可能是關(guān)鍵因素。已有報道指出靈芝多糖具有很好的抗氧化損傷作用(Bohetal.2007;Xieetal.2006),其抗氧化損傷效果也可能是減輕順鉑所致惡心嘔吐的重要原因,但靈芝多糖是否減少了5-HT的釋放,以及對5-HT3受體是否具有抑制作用尚待進一步研究。Fos蛋白是c-fos基因的表達產(chǎn)物,該基因是一種即刻早期基因,其表達增強可說明在特定條件下有關(guān)神經(jīng)元的活動發(fā)生了變化,因此被廣泛用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能活動的形態(tài)定位。結(jié)果顯示,小鼠腹腔內(nèi)注射順鉑后,所觀察核團內(nèi)的FLI神經(jīng)元數(shù)明顯增多,如果在注射順鉑之前,預(yù)先給以格拉司瓊或靈芝多糖,各核團內(nèi)FLI神經(jīng)元數(shù)則顯著減少,其總體變化趨勢與高嶺土攝取量的變化基本一致,表明Fos蛋白表達水平反映了順鉑致惡心嘔吐的程度,也進一步說明靈芝多糖對于順鉑所致嘔吐作用具有確切的抑制效果。普遍認(rèn)為AP是催吐化學(xué)感受區(qū)(chemoreceptortriggerzone)所在位置,Sol、PBN、Arc等均參與惡心嘔吐反應(yīng),這幾個核團內(nèi)Fos蛋白表達水平的變化與惡心嘔吐的關(guān)系基本上可以肯定。本研究還發(fā)現(xiàn)注射順鉑使前庭核內(nèi)FLI神經(jīng)元增多,而聯(lián)合應(yīng)用格拉司瓊或靈芝多糖后前庭核內(nèi)FLI神經(jīng)元減少,提示順鉑還可能通過刺激前庭核引起嘔吐,而格拉司瓊或靈芝多糖減輕順鉑對前庭核的刺激從而發(fā)揮止吐作用。在注射順鉑,以及給以格拉司瓊或靈芝多糖后其它核團內(nèi)FLI神經(jīng)元數(shù)發(fā)生變化有何意義尚不清楚,或存在其它值得研究的問題。另外,靈芝多糖+順鉑組的高嶺土攝取量在第1d明顯少于格拉司瓊+順鉑組(P<0.05),第2-4d與格拉司瓊+順鉑組之間的差別雖沒有統(tǒng)計學(xué)意義,但顯示了低于格拉司瓊+順鉑組的趨勢;從腦內(nèi)Fos蛋白表達水平來看,靈芝多糖+順鉑組的AP、PBN、Arc和LPGi內(nèi)的FLI神經(jīng)元數(shù)與格拉司瓊+順鉑組之間的差別雖無統(tǒng)計學(xué)意義,但表現(xiàn)出多于格拉司瓊+順鉑組的趨勢,LC、SolM、PVN和MVe-SpVe內(nèi)FLI神經(jīng)元數(shù)要多于格拉司瓊+順鉑組(P<0.05),這一現(xiàn)象提示靈芝多糖對順鉑所致惡心嘔吐的抑制作用可能存在與格拉司瓊不同的機制,例如通過抗氧化損傷、免疫調(diào)節(jié)作用(Zhuetal.2007)等,提高機體對順鉑毒性的耐受性。綜上所述,靈芝多糖可以有效抑制順鉑引起的小鼠高嶺土攝取和腦內(nèi)Fos蛋白表達增多,對于預(yù)防和治療化療所致惡心嘔吐具有一定的開發(fā)和應(yīng)用前景。1.4.2兔抗c-fos抗體的檢測將切片用兔抗c-fos