高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定血漿中青蒿素的藥動(dòng)學(xué)研究

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定血漿中青蒿素的藥動(dòng)學(xué)研究

青艾酒是中國(guó)科學(xué)家在20世紀(jì)70年代發(fā)明的一種新結(jié)構(gòu)的抗癲癇藥物。自上市以來(lái)，這種藥物在世界上挽救了數(shù)億只瘧疾患者的生命。它被稱為抗癲癇藥物發(fā)展史上的第三個(gè)里程碑，它被稱為奎寧和氯仿后的第三個(gè)里程碑。青蒿素的發(fā)現(xiàn),是中國(guó)科學(xué)家為人類拯救生命做出的重要貢獻(xiàn)。由于這類藥物與以往的抗瘧藥結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制完全不同,速效又安全,且與現(xiàn)有藥物均無(wú)交叉抗藥性,幾十年來(lái)青蒿素類抗瘧藥一直是WHO關(guān)注的重點(diǎn)。青蒿素類藥物由于化學(xué)結(jié)構(gòu)的特殊性,一直沒有理想的檢測(cè)方法,為此,本研究建立了人體內(nèi)青蒿素濃度的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS-MS)的分析法,并將其用于中國(guó)健康志愿者體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究。藥品、試劑與儀器1藥品、試劑與儀器青蒿素片,規(guī)格:每片250mg,批號(hào):20051021-1,由昆明制藥集團(tuán)股份有限公司提供;青蒿素標(biāo)準(zhǔn)品,含量:99.0%,批號(hào):100202-200402,中國(guó)生物制品藥品檢定所提供;內(nèi)標(biāo):替米沙坦,含量:99.5%,批號(hào):020801,北京致至醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司提供。Q-TrapTM三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀,配有離子噴霧離子源以及Analyst1.3.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),美國(guó)AppliedBiosystem公司產(chǎn)品;1100高效液相色譜輸液泵,美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品。2入院前未服用其他藥物2.1受試者選擇健康男性受試者10人,年齡:(34.3±3.16)歲,身高:(1.67±0.06)m,體質(zhì)量:(61.2±6.11)kg。試驗(yàn)前經(jīng)全面體檢,肝、腎功能、血、尿常規(guī)、心電圖、血清學(xué)檢查均正常。半月內(nèi)未服用任何藥物,3個(gè)月內(nèi)未參加過(guò)其他藥物試驗(yàn)者。試驗(yàn)前簽署書面知情同意書。2.2分組、給藥與服本研究為單劑開放試驗(yàn)設(shè)計(jì),試驗(yàn)方案經(jīng)中國(guó)人民解放軍307醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。受試者藥前禁食10h,給藥劑量為1000mg(4片),溫開水250mL1次口服;給藥2h后方可飲水,4h后統(tǒng)一進(jìn)低脂膳食。于給藥前(0h)、給藥后15、30、45min及1、1.5、2、3、4、6、8、12、18、24h,在肘靜脈取血5mL,置肝素試管中,3000r·min-1離心10min,分離血漿,于-20℃保存?zhèn)溆谩?質(zhì)譜條件和檢測(cè)方法3.1分析條件色譜ZorbaxextendC18色譜柱(4.6mm×150mm,5μm,美國(guó)Agilent公司);流動(dòng)相:甲醇-10mmol·L-1乙酸銨(80∶20);流量:1.2mL·min-1(分流體積比1∶1);柱溫:40℃;進(jìn)樣量:10μL。質(zhì)譜離子源:離子噴霧離子化源;離子噴射電壓:5500V;溫度:450℃;源內(nèi)氣體1(GS1,N2),壓力:448.18kPa;氣體2(GS2,N2),壓力:448.18kPa;氣簾氣體(N2)壓力:137.90kPa;正離子方式檢測(cè);掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);碰撞氣(N2)設(shè)置為Medium;青蒿素和內(nèi)標(biāo)替米沙坦的解簇電壓(DP)分別為100、90V;碰撞能量(CE)分別為11、60eV;用于定量分析的離子反應(yīng)分別為m/z283.3→m/z209.1和m/z515.20→m/z276.10。3.2在混合中添加乙烯-二氯甲烷固相液5.取血漿樣品100μL置具塞試管中,加入內(nèi)標(biāo)溶液100μL(40μg·L-1替米沙坦),補(bǔ)加甲醇-水(50∶50)混合溶液100μL,混勻;加入乙醚-二氯甲烷(60∶40),渦流混合1min,往復(fù)振蕩10min(每分240次),離心5min(15000r·min-1);取上層有機(jī)相于另一試管中,25℃氮?dú)饬飨麓蹈?殘留物加入流動(dòng)相150μL立即溶解,渦流混合,進(jìn)樣10μL進(jìn)行LC-MS-MS分析。4標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線制備在健康人空白血漿中,加入內(nèi)標(biāo)100μL及不同量的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液100mL,使青蒿素濃度分別為4、10、30、100、300和1000μg·L-1。按樣品處理與測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定,待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo),用加權(quán)(W=1/x2)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算,得回歸方程:Y=7.81×10-4X+1.21×10-3,γ=0.9990。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,本方法的線性范圍為4~1000μg·L-1;最低定量限為4μg·L-1。4.2準(zhǔn)確度和精密度在空白人血漿中,加入不同量的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液100mL,制備青蒿素低、中、高3個(gè)濃度(10、100、800μg·L-1)的質(zhì)量控制(QC)樣品,每濃度6樣本,連續(xù)測(cè)定3天,根據(jù)當(dāng)日的工作曲線,計(jì)算QC樣品的測(cè)得濃度,根據(jù)QC樣品結(jié)果,計(jì)算本法的準(zhǔn)確度與精密度。血樣中,低、中、高日內(nèi)變異分別為8.21%、4.07%、7.16%;日間變異分別為6.49%、4.58%、9.91%。方法學(xué)相對(duì)回收率分別為(93.3±9.81)%、(86.1±5.29)%、(89.2±3.50)%。4.3血漿青蒿素濃度檢測(cè)依據(jù)“標(biāo)準(zhǔn)曲線”項(xiàng)下方法,制備穩(wěn)定性QC樣品,每一濃度測(cè)定3樣本,經(jīng)反復(fù)3次,于-20℃冰凍,室溫溶解后,測(cè)定樣品濃度。凍融后,測(cè)定血漿青蒿素濃度分別為(9.69±0.71)、(107.67±3.51)和(787.33±83.03)μg·L-1。所有凍融試驗(yàn)測(cè)定值與標(biāo)示濃度的相對(duì)偏差(RE%)均<15%。4.4青蒿素和內(nèi)標(biāo)替米沙坦標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制取空白血漿100mL,按“樣品處理”項(xiàng)操作,得色譜圖1A;將一定濃度的青蒿素和內(nèi)標(biāo)替米沙坦標(biāo)準(zhǔn)溶液加入空白血漿中,同法操作,得色譜圖1B;取受試者給藥后收集的血漿樣品,同法操作,得色譜圖1C。結(jié)果表明,空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾青蒿素和內(nèi)標(biāo)替米沙坦的測(cè)定。5auc0-的測(cè)量以梯形面積法計(jì)算AUC0-tn;Cmax、tmax為實(shí)測(cè)值。AUC0-∞=AUC0-tn+Ctn/ke;其他藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)采用中國(guó)藥理學(xué)會(huì)數(shù)學(xué)藥理委員會(huì)編制的3P97藥代動(dòng)力學(xué)程序軟件計(jì)算。結(jié)果1血藥濃度-時(shí)間曲線10名受試者空腹口服青蒿素片1000mg的平均血藥濃度-時(shí)間曲線,見圖2。2藥房動(dòng)態(tài)參數(shù)按統(tǒng)計(jì)處理方案,計(jì)算每個(gè)受試者的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù),10名受試者空腹口服青蒿素片1000mg的平均藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù),見下表。質(zhì)譜條件分析青蒿素類藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)中,缺少可利用的功能基團(tuán),本身只有紫外末端吸收,如用紫外吸收光譜法測(cè)定,結(jié)果不穩(wěn)定。國(guó)外報(bào)道,主要采用高效液相n=10,mean±SD色譜法結(jié)合電化學(xué)檢測(cè)器,在裝置上要求比較嚴(yán)格。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來(lái)的將液相色譜分離技術(shù)與質(zhì)譜檢測(cè)手段結(jié)合。本實(shí)驗(yàn)建立了簡(jiǎn)單、快速、高靈敏度的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)青蒿素的方法,并進(jìn)行了人體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的研究,該方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線、最低定量限、精密度、準(zhǔn)確度及穩(wěn)定性均達(dá)到生物樣品測(cè)定的要