大鼠腹膜傷害性刺激cfos在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)及分布

大鼠腹膜傷害性刺激cfos在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)及分布

創(chuàng)傷引起的疼痛是神經(jīng)系統(tǒng)的一個重要機制。然而，到目前為止，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疼痛和疼痛生成機制尚不清楚，這使得理解疼痛機制變得困難。傷害性刺激引起腹痛是常見的臨床癥狀,但哪些中樞結(jié)構(gòu)與傷害性刺激引起的腹痛有關(guān),目前還不十分清楚。本研究將1%的乙酸注入大鼠腹膜腔,造成經(jīng)典腹腔痛覺刺激模型,觀察中樞神經(jīng)系統(tǒng)的c-fos陽性神經(jīng)元出現(xiàn)的時間和分布規(guī)律,進(jìn)而研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)與傷害性刺激引起腹腔痛覺的相關(guān)結(jié)構(gòu)。1材料和方法1.1飼養(yǎng)環(huán)境分組選用健康Wistar大鼠56只,雌雄不限(新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供),體重250～300g。置于安靜、溫暖(20℃)、避強光的環(huán)境中飼養(yǎng)48h。隨機分為實驗組(n=48)和對照組(A組,n=8)。實驗組:動物注射乙酸后分別存活30min(n=8)、1h(n=8)、2h(n=8)、4h(n=8)、6h(n=8)、8h(n=8),將其依次分為B組、C組、D組、E組、F組、G組。1.2大鼠的起效試驗(1)實驗組:將大鼠放置于透明的有機玻璃盒內(nèi),滴入少許乙醚,麻醉起效后,將大鼠立即取出,并向腹膜腔注射1%乙酸2ml。(2)對照組:將大鼠在術(shù)前環(huán)境內(nèi)喂養(yǎng)48h,不給予腹腔刺激,常規(guī)麻醉灌注處死。1.3聚甲醛液的灌裝將大鼠開胸,經(jīng)心臟灌注0.9%氯化鈉注射液150ml以沖凈血液,采用4%多聚甲醛液先快灌200ml,然后再慢灌200ml,即可固定。速取全腦與脊髓,放入10%福爾馬林液固定待用。于T6～L3脊髓后角、延髓孤束核、臂旁核、藍(lán)斑核、中縫背核、下丘腦、室旁核、視上核、杏仁核所在部位做冠狀切片(片厚4μm)。1.4dab/蘇蘇染片染色(1)常規(guī)HE染色核細(xì)胞團,功能區(qū)定位選片。(2)抗c-fos免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物公司,切片染色步驟按此盒說明進(jìn)行,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,封片,觀察。以細(xì)胞核染成棕黃色為c-fos陽性細(xì)胞,c-fos陽性神經(jīng)元的數(shù)量以每單位視野(200μm2)內(nèi)c-fos陽性神經(jīng)元數(shù)目來表示。1.5統(tǒng)計處理采用SPLM軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,所得數(shù)據(jù)均用xˉ±sxˉ±s表示,組間比較采用t檢驗,檢驗水準(zhǔn)α=0.05。2結(jié)果2.1對照組c-fos免疫染色結(jié)果T6～L3脊髓后角、臂旁核、室旁核可檢出少量c-fos陽性神經(jīng)元。2.2各組中縫背核c-fos表達(dá)情況比較動物被灌注固定后腹腔解剖,肉眼可見腹膜充血水腫,大網(wǎng)膜滲出增加,有腹膜炎的病理特征。B、C、D、E、F組與A組比較c-fos表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),B組與C、D、E組比較差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),D組與E組比較c-fos表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),D、E組與G組比較c-fos表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),A組與G組比較c-fos表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),結(jié)果見表1。結(jié)合圖1可知,c-fos表達(dá)通常于灌注30min開始,2h到達(dá)高峰,于4h后開始下降,8h接近正常水平,在灌注2～4h后脊髓T6～L3后角、孤束核、臂旁核與藍(lán)斑核、中縫背核c-fos表達(dá)最為強烈,中縫背核與前述核團比較c-fos表達(dá)弱且持續(xù)的時間較短;下丘腦、視上核、室旁核、杏仁核c-fos表達(dá)也較明顯。3c-fos陽性神經(jīng)元/傷害性刺激c-fos癌基因存在于包括神經(jīng)元在內(nèi)的絕大多數(shù)細(xì)胞中,當(dāng)機體受到疼痛刺激后,在其痛覺傳導(dǎo)路中的所有神經(jīng)元即會作出反應(yīng),并且激活神經(jīng)元內(nèi)的c-fos癌基因。c-fos癌基因轉(zhuǎn)錄并翻譯為Fos蛋白。Fos蛋白實質(zhì)是一種細(xì)胞核的磷酸蛋白,它在胞漿內(nèi)合成,然后進(jìn)入胞核,與DNA結(jié)合后調(diào)節(jié)其它基因的轉(zhuǎn)錄,機體從受到刺激到翻譯出Fos蛋白,約需30min時間。給予動物痛覺刺激后,用免疫組織化學(xué)方法可檢測Fos蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的表達(dá)及分布狀態(tài),從而可顯示中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)與傷害性刺激引起腹痛的有關(guān)核團。本研究結(jié)果表明,實驗組與對照組Fos蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),脊髓T6～L3后角、孤束核、臂旁核與藍(lán)斑核、中縫背核、下丘腦、視上核、室旁核、杏仁核c-fos表達(dá)常于灌注30min開始,2h到達(dá)高峰,于4h后開始下降,8h接近正常水平,從而可推知這些核團與傷害性刺激引起的腹腔痛覺相關(guān)。將大鼠腹腔注入乙酸后,發(fā)生化學(xué)性炎癥,造成腹膜炎的病理模型。乙酸注入腹膜腔后所誘發(fā)疼痛的來源有兩種,即軀體痛和內(nèi)臟痛。壁腹膜受到的刺激所產(chǎn)生的沖動是由脊神經(jīng)傳導(dǎo)的,屬于軀體感覺。腹腔臟器的痛覺由迷走神經(jīng)及交感神經(jīng)傳入,屬于內(nèi)臟感覺。因此,中樞c-fos陽性神經(jīng)元就有兩條被激活的途徑,即軀體痛傳入和內(nèi)臟痛傳入。本研究采用經(jīng)典腹腔痛覺刺激模型具有方便、經(jīng)濟等優(yōu)點,但該模型不能明確區(qū)分軀體痛傳入和內(nèi)臟痛傳入,有待今后進(jìn)一步改進(jìn)。本實驗結(jié)果表明,在灌注2～4hT6～L3脊髓后角、孤束核、臂旁核與藍(lán)斑核、中縫背核c-fos表達(dá)最為強烈,這與王強武等的實驗結(jié)果有相似之處,并且下丘腦、視上核、室旁核、杏仁核c-fos表達(dá)也較明顯。這些核團有的是內(nèi)臟感覺的初級傳入直接終止的部位,有的與痛覺傳導(dǎo)有關(guān),有的參與鎮(zhèn)痛,有的參與情緒反應(yīng),而且這些核團之間都有纖維聯(lián)系。Kalia等采用辣根過氧化物酶(HRP)法證明腹腔臟器的初級傳入經(jīng)迷走神經(jīng)終止孤束核,而軀體的疼痛刺激可經(jīng)脊神經(jīng)到脊髓后角,再由脊髓后角到孤束核及臂旁核,一般認(rèn)為臂旁核是感覺中繼核。Hylden等研究證實脊髓到臂旁核通路主要參與傳遞特異性傷害信息。因此,孤束核、臂旁核都是直接或間接的接受傷害刺激引起痛覺的信息核團,有較強的c-fos表達(dá),且持續(xù)時間較長,黨小榮等的實驗結(jié)果證實了此觀點。據(jù)Astonjones等報道,藍(lán)斑與腦內(nèi)多種結(jié)構(gòu)有廣泛的聯(lián)系,并與多種感覺調(diào)節(jié)有關(guān)。藍(lán)斑內(nèi)有較多的c-fos陽性神經(jīng)元,說明藍(lán)斑可能與腹膜傷害性刺激所引起腹腔痛覺有關(guān)。中縫背核的c-fos表達(dá)較弱一些,且持續(xù)的時間較短,提示中縫背核接受孤束核的投射,也參與鎮(zhèn)痛。下丘腦、室旁核、視上核、杏仁核有較明顯的c-fos表達(dá),這可能是孤束核上行投射激活的作用結(jié)果。由此可見,下丘腦、室旁核、視上核、杏仁核在傷害性刺激引起腹腔痛覺信息傳遞中起中繼作用,即跨神經(jīng)元的作用