多囊卵巢綜合征大鼠抗苗勒管素表達(dá)與胰島素抵抗的相關(guān)性研究

多囊卵巢綜合征大鼠抗苗勒管素表達(dá)與胰島素抵抗的相關(guān)性研究

多囊卵巢綜合征（p-co）是一種發(fā)育障礙和高度異質(zhì)性的發(fā)育障礙。其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。高胰島素血癥及高雄激素血癥是PCOS患者主要的內(nèi)分泌紊亂特征,是引起PCOS患者局部病理變化的病理生理基礎(chǔ);AMH作為卵巢局部一種重要的調(diào)節(jié)因子,在PCOS的發(fā)病中的相關(guān)作用近年來成為研究熱點(diǎn)。目前的研究認(rèn)為,高雄激素的發(fā)生可能與AMH有一定的相關(guān)性［1］,也有學(xué)者認(rèn)為PCOS患者雄激素水平的升高可能與多囊卵巢組織自身存在IR有關(guān)［2］。目前對于卵泡生長發(fā)育過程中AMH和IR兩者間是否存在相互作用尚未有深入的研究報道。因而,我們通過制作PCOS大鼠模型,探討卵巢局部及單卵泡AMH表達(dá)與IR之間的相關(guān)性,以期對PCOS發(fā)病機(jī)理及臨床異質(zhì)性的分子機(jī)制的探討提供一些實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1amh、ir表達(dá)強(qiáng)度的檢測1.1實(shí)驗(yàn)對象采用孕激素聯(lián)合hCG法制作P-COS模型的SD雌鼠作為研究組［3］,相應(yīng)SD雌鼠作為對照組。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1血清相關(guān)指標(biāo)測定大鼠于42日齡左右,陰道涂片示動情間期當(dāng)晚8∶00禁食,次晨8∶00稱重。腹腔注入10%水合氯醛麻醉,行腹主動脈取血5~8ml,靜置30min后將全血3000r/min離心10min得血清。用ELISA方法測定空腹血糖值(Fast-ingbloodglucose,FPG)、血胰島素(Fins);放射性免疫法檢測血清黃體生成素(Luteinizinghormone,LH)和卵泡刺激素(Folliclestimulatinghormone,FSH);化學(xué)發(fā)光法檢測血清雌二醇(Estradiol,E2)、孕酮(Progesterone,P)及睪酮(Testosterone,T)水平;計(jì)算LH/FSH及HOMA-IR指數(shù)(HOMA-IR=FPG×FINS/22.5)。將經(jīng)病理證實(shí)建模成功的大鼠共37只按HOMA指數(shù)由小到大排列,取前10只和后10只,中間17只大鼠剔除實(shí)驗(yàn);對照組隨機(jī)取10只。按照α=0.05的標(biāo)準(zhǔn),將其分別與對照組行兩t檢驗(yàn),成功分為三組:與對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的為PCOS無IR組(n=10),有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的為PCOS并IR組(n=10),對照組(n=10)。1.2.2卵巢組織免疫組織化學(xué)分析將入選大鼠卵巢石蠟包埋,切片;采用免疫組化Envision法進(jìn)行檢測,按照ChemMateTMEnvision+HRP或DAB檢測試劑盒說明書進(jìn)行,工作濃度為1∶20,以細(xì)胞質(zhì)中有棕黃色或者棕褐色顆粒出現(xiàn)為陽性表達(dá)。1.2.3單卵泡AMH與Ir表達(dá)強(qiáng)度比較高倍鏡下(×200)每張免疫組化圖片中計(jì)數(shù)卵泡直徑<5mm的竇前卵泡5個,計(jì)算每個卵泡陽性單位(PU值),則每張圖片的PU=1/5(PU1+PU2+PU3+PU4+PU5),圖像分析采用LeicaQwin計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)自動測試。高倍鏡下(×200)隨機(jī)取5個單卵泡視野,計(jì)算陽性單位(PU)行AMH和Ir表達(dá)強(qiáng)度的半定量分析。PU=(Gα-Gβ)/Gmax×100,Gα為待測部分平均灰度,Gβ為背景平均灰度,Gmax=256為檢測儀器的最大灰度。1.2.4卵巢局部AMH與Ir表達(dá)強(qiáng)度比較同一大鼠卵巢制備的2張切片分別行AMH和Ir的免疫組化,取相同放大倍數(shù)(×20)同等面積,盡量選取2~3處相同區(qū)域,分別計(jì)算此區(qū)域AMH和Ir表達(dá)強(qiáng)度的PU值,最后取平均值?？杀硎久恳宦殉驳腁MH和Ir表達(dá)強(qiáng)度,進(jìn)行比較和相關(guān)性分析。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)均以x－±s表示,采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,組間差異比較時,若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布,采用t檢驗(yàn)和方差分析,若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布,經(jīng)LN數(shù)學(xué)換算,若新變量符合正態(tài)分布,仍采用t檢驗(yàn)和方差分析,否則采用Mann-whitneyU檢驗(yàn)和Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2amh表達(dá)強(qiáng)度的相關(guān)性分析2.1血清指標(biāo)檢測結(jié)果三組間LH/FSH水平無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,實(shí)驗(yàn)組T及Fins水平明顯高于對照組(P<0.05);PCOS無IR組FPG水平與對照組無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);PCOS并IR組的血清T和Fins較無IR組更高(P<0.05)。見表1。2.3卵巢局部AMH表達(dá)及與Ir表達(dá)強(qiáng)度比較及相關(guān)性分析由表3可知,實(shí)驗(yàn)組與對照組相比卵巢局部AMH表達(dá)有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;對照組、P-COS無IR和PCOS合并IR三組間經(jīng)多樣本t檢驗(yàn)知三組間卵巢局部AMH表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,三者間呈一遞增型階梯樣分布(P<0.05,見表2、3)。而各組別相比,Ir均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。行二者間相關(guān)性分析,結(jié)果顯示卵巢局部AMH表達(dá)強(qiáng)度與Ir表達(dá)強(qiáng)度無明顯相關(guān)性(r=0.000,P>0.05)見圖1、2。2.4卵巢單卵泡AMH與Ir表達(dá)強(qiáng)度比較及相關(guān)性分析PCOS合并IR、PCOS無IR、對照組三組間經(jīng)多樣本t檢驗(yàn)知,單卵泡的AMH及Ir表達(dá)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);行二者間相關(guān)性分析,結(jié)果顯示單卵泡AMH表達(dá)強(qiáng)度與Ir表達(dá)強(qiáng)度無明顯相關(guān)性(r=0.011,P>0.05)。見表4,圖3、4。3amh與ir的相互作用我們的前期研究對PCOS模型血清及卵巢局部AMH水平與胰島素抵抗水平的關(guān)系進(jìn)行了初步分析,結(jié)果表明,不管是否合并IR,PCOS大鼠實(shí)驗(yàn)組的血清AMH明顯高于對照組,且與HOMA指數(shù)、血清T及FIns水平呈正相關(guān)［3］。提示血清AMH水平與高雄激素和高胰島素血癥之間存在一定的相關(guān)性。為進(jìn)一步探討在卵巢局部及單卵泡AMH與Ins之間的相互調(diào)節(jié)作用,本研究對PCOS模型卵巢局部及單卵泡AMH表達(dá)與IR的關(guān)系進(jìn)行了初步分析。3.1卵巢局部AMH表達(dá)與IR的相關(guān)性AMH是轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)超家族的成員,在女性中僅表達(dá)于卵巢,通過降低生長卵泡對FSH的敏感性來參與卵泡生長發(fā)育。Hart［4］的研究發(fā)現(xiàn),PCOS患者血清中AMH水平與血清中雄激素水平和胰島素水平呈正相關(guān)［4］。我們的研究結(jié)果表明:不管是否合并IR,PCOS組與對照組相比,血清FIns均有顯著性差異(P<0.05),表現(xiàn)為代償性胰島素升高(CHI),而空腹血糖無顯著差異;對照組、PCOS無IR組和PCOS合并IR組三組卵巢局部AMH表達(dá)呈遞增型階梯樣分布(P<0.05),提示卵巢局部AMH表達(dá)與血清胰島素水平呈正相關(guān),其表達(dá)受血中Ins水平的調(diào)控。在PCOS患者中,過高的Ins促進(jìn)了卵泡的募集［5］,而卵泡募集的增加導(dǎo)致小竇卵泡的數(shù)量增多,小竇卵泡募集的增加會產(chǎn)生相當(dāng)數(shù)量的AMH。AMH抑制顆粒細(xì)胞芳香化酶活性,一方面降低了卵泡對FSH的敏感性,導(dǎo)致卵泡發(fā)育受阻,優(yōu)勢卵泡選擇失敗;另一方面使雄激素合成增加,雄激素可刺激小竇卵泡數(shù)目增加產(chǎn)生更多AMH,AMH與雄激素之間形成一種正反饋的惡性循環(huán)［3］。提示AMH和Ins二者的相互作用均可能與PCOS患者的高雄激素特征有關(guān),推測在卵巢局部AMH、Ins和雄激素三者之間形成一個網(wǎng)絡(luò),相互影響,其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步探討明確。3.2卵巢單卵泡AMH表達(dá)與IR的相關(guān)性目前研究就PCOS單個卵泡中的AMH水平變化存在不同看法:李鍵等研究表明PCOS單個卵泡中的AMH顯著升高［1］,但Pigny等［6］認(rèn)為PCOS患者中血清AMH水平升高是由于小竇卵泡數(shù)目的增加,而各個卵泡分泌的AMH量仍在正常范圍內(nèi)。目前的臨床研究表明,對PCOS患者予以短期胰島素增敏劑Metformin治療,可有效改善高雄激素血癥、減少竇前卵泡數(shù)量,提高Ins敏感性,改善IR［7］;長期Met-formin治療則有望降低AMH水平［8］。本研究結(jié)果表明,建模的PCOS大鼠單個卵泡AMH水平在P-COS無IR、PCOS合并IR及對照組之間未見明顯差異。推測在PCOS患者中,在高胰島素的作用下,垂體分泌LH增高,促進(jìn)卵巢雄激素合成;在原始卵泡期,雄激素促進(jìn)多個卵泡生長,單卵泡中AMH的合成量不受影響,由于卵泡數(shù)目增加,使卵巢局部表現(xiàn)為AMH和胰島素抵抗水平的正相關(guān)性,而單卵泡的AMH表達(dá)無明顯變化。3.3Ir表達(dá)與IR的相關(guān)性胰島素可刺激類固醇激素分泌,在各級卵泡細(xì)胞膜表面及卵巢間質(zhì)均有Ir的表達(dá),對卵巢功能的調(diào)節(jié)發(fā)揮著重要作用。其生理作用的發(fā)揮依賴于Ins和Ir的特異性結(jié)合,機(jī)體發(fā)生IR時,胰島素代謝途徑出現(xiàn)不協(xié)調(diào),表現(xiàn)為促代謝作用途徑受損,促分裂途徑發(fā)生放大現(xiàn)象。吳效科等［9］研究證實(shí),PCOS顆粒細(xì)胞中胰島素功能表現(xiàn)選擇性缺陷,促代謝途徑存在抵抗而促分裂途徑增強(qiáng)。早期研究認(rèn)為,PCOS代償性高胰島素將降調(diào)節(jié)Ir數(shù)目,IR主要由Ir數(shù)目減少引起。目前普遍認(rèn)為PCOS的Ir數(shù)目并沒有減少。我們的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也表明,不管是否合并IR,PCOS組與對照組相比,卵巢局部和單卵泡Ir表達(dá)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);相關(guān)性分析顯示卵巢局部及單卵泡AMH表達(dá)強(qiáng)度與Ir表達(dá)強(qiáng)度無明顯相關(guān)性(r=0.000,P>0.05)。與李小永等人［10］的觀點(diǎn)一致。裴全秀［11］認(rèn)為,PCOS患者的InsR功能可能正常,但受體的異常絲氨酸磷酸化可能損害信號傳導(dǎo)。而朱亮等［12］從表觀遺傳學(xué)角度發(fā)現(xiàn),PCOS的IR不僅僅發(fā)生在受體后水平,Ir本身也有功能異常,表現(xiàn)為Ir基因甲基化異常。支持IR產(chǎn)生的原因與Ir本身結(jié)構(gòu)或功能異常,或受體后缺陷等原因有關(guān)。我們的研究結(jié)果表明,不管是在卵巢局部或單卵泡,Ir數(shù)量表達(dá)與AMH表達(dá)和IR無相關(guān)性(P>0.05);而卵巢局部AMH表達(dá)與血清胰島素水平呈正相關(guān);在單卵泡的AMH表達(dá)無明顯變化。提示PCOS卵巢局部AMH的高表達(dá)與高胰島素血癥的發(fā)生具有相關(guān)性。推測在AMH與IR的相互作用中,AMH可能阻礙了雄激素向雌激素轉(zhuǎn)化,與高雄激素之間形成正反饋［1］;同時多囊卵巢自身IR也加重高雄激素發(fā)生［2］。卵巢局部在高雄激素的刺激下小竇卵泡數(shù)目增加,使卵巢局部產(chǎn)生更多AMH而單個卵泡的AMH無明顯變化;過高的胰島素使垂體分