股骨頭缺血性壞死患者骨髓瘦素與局部微環(huán)境指標(biāo)相關(guān)性研究

股骨頭缺血性壞死患者骨髓瘦素與局部微環(huán)境指標(biāo)相關(guān)性研究

股骨頭壞死（anfh）是骨科常見病之一，通常發(fā)生在35至55歲的年輕人。如果不及時治療，約70%的患者會出現(xiàn)股骨頭塌陷和骨關(guān)節(jié)炎，嚴重影響生活質(zhì)量。激素和酒精的過量攝入被認為是ANFH的常見病因,但具體致病機制仍未明確。研究表明,ANFH與骨髓脂肪化相關(guān)。瘦素在調(diào)節(jié)脂代謝與骨代謝中發(fā)揮重要作用,可能是聯(lián)系兩種代謝的重要因子。但目前關(guān)于瘦素在骨髓微環(huán)境中表達情況及其與ANFH關(guān)系的報道較少。本研究通過對比ANFH股骨頭與正常股骨頭局部微環(huán)境瘦素水平與骨、脂代謝指標(biāo),觀察其變化情況。1材料和方法1.1x線片面表及mri表現(xiàn)實驗標(biāo)本均由2009年7月-2011年2月于我院接受治療的患者自愿捐贈。其中ANFH患者16例(ANFH組),年齡46~61歲,平均55.7歲;體重56~64kg,平均57.2kg;體重指數(shù)(bodymassindex,BMI)20.7~26.8,平均22.7。左側(cè)9例,右側(cè)7例。其中激素性10例(激素暴露閾值大于或等效于2000mg潑尼松龍),酒精性6例(每周飲酒400mL以上)。均參照Sugano等的標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)X線片與MRI確診為ANFH。股骨上段骨折或創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎患者11例(對照組),年齡50~64歲,平均56歲;體重55~67kg,平均60.8kg;BMI23.1~27.6,平均25.1。左側(cè)6例,右側(cè)5例?；颊呔懦愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)締組織病、內(nèi)分泌疾病、肝腎疾病、關(guān)節(jié)結(jié)核及腫瘤等疾病。兩組年齡、體重及BMI比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性?；颊咝g(shù)前均禁食、禁水超過8h。1.2elisa試驗小鼠抗人瘦素抗體由我院內(nèi)分泌科實驗室饋贈;免疫組織化學(xué)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);人瘦素、骨保護素(osteoprotegerin,OPG)、可溶性瘦素受體(solubleleptinreceptor,sLR)、可溶性NF-κB受體活化因子配基(solublereceptoractivatorofNF-κB,sRANKL)ELISA試劑盒(北京愛迪博生物科技有限公司)。Lx20ClinicalSystem全自動生化分析儀(Beckman公司,美國)。1.3測試指標(biāo)1.3.1髓內(nèi)脂肪組織成分分析按照Martin等的方法進行檢測。術(shù)中抽取兩組患者骨髓約6mL置于抗凝試管內(nèi),吸取其中4mL脫鈣后4~6μm厚連續(xù)切片,HE染色。采用標(biāo)準(zhǔn)體視學(xué)成像分析技術(shù)分析髓內(nèi)脂肪組織(freefat,FF)含量。采集兩組患者空腹非抗凝血3mL,以600×g離心5min后獲取血清,采用Lx20ClinicalSystem全自動生化分析儀檢測血脂水平,包括甘油三脂(triglyceride,TG)、總膽固醇(totalcholesterol,TC)、低密度脂蛋白(lowdensitylipoprotein,LDL)。1.3.2脫鈣、脫水、切片取ANFH組股骨頭標(biāo)本,沿正中冠狀面劈開,制成0.6cm×0.3cm×0.2cm大小骨片;對照組取股骨頭松質(zhì)骨碎片。生理鹽水清洗后置于固定液中,4℃固定12~24h,PBS充分漂洗后,置于脫鈣液中,4℃脫鈣7~10d至完全脫鈣。蒸餾水沖洗20min,常規(guī)脫水、包埋、切片。按試劑盒說明分別滴加瘦素及瘦素受體抗體進行孵育,PBS沖洗,DAB染色,鏡下觀察呈黃褐色的瘦素表達陽性細胞。每個標(biāo)本取3張切片,每個切片取5個視野計數(shù)陽性細胞,取均值,按以下公式計算瘦素陽性細胞表達百分率:陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。1.3.3樣本品質(zhì)測定取術(shù)中抽取的剩余2mL骨髓同上法離心后,吸取500~800μL上清,按照ELISA試劑盒說明檢測標(biāo)本瘦素、sLR、OPG及sRANKL水平。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(A)值,通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中瘦素、sLR、OPG及sRANKL濃度,并計算瘦素生物學(xué)活性及破骨細胞活性,分別以瘦素/sLR及sRANKL/OPG表示。1.4生物測定的指導(dǎo)思想比較見表1應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用t檢驗;瘦素水平與sLR、瘦素生物學(xué)活性、OPG、sRANKL及骨髓FF含量指標(biāo)間相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān);檢驗水準(zhǔn)α=0.05。2結(jié)果2.1骨髓ff含量測定t兩組外周血標(biāo)本血脂水平(TG、TC、LDL)比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),但骨髓FF含量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=—14.230,P=0.000)。見表1。2.2各組肥素陽性細胞表達情況比較鏡下觀察示,兩組標(biāo)本骨細胞及骨髓基質(zhì)細胞中均有瘦素表達,但ANFH組陽性表達細胞較對照組顯著減少(圖1)。ANFH組瘦素陽性細胞表達百分率為20.64%±13.54%,對照組為35.02%±9.71%,比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.425,P=0.002);瘦素受體陽性細胞表達百分率分別為14.93%±11.57%及17.54%±7.26%,比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.630,P=0.116)。2.3各組脂質(zhì)細胞菌活性比較兩組骨髓瘦素、OPG、sRANKL含量比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);sLR含量比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.683,P=0.551)。見表1。ANFH組和對照組瘦素生物學(xué)活性分別為0.29±0.32和0.48±0.41,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.127,P=0.001);破骨細胞活性分別為0.09±0.02和0.04±0.02,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.162,P=0.004)。2.4opg、ff、sslart、rokenl、srakenl含量與其他指標(biāo)相關(guān)性表1在所有患者中,髓內(nèi)瘦素水平與瘦素生物學(xué)活性成正相關(guān)(r=0.9227,P=0.0000),與OPG含量成負相關(guān)(r=—0.3962,P=0.0408),與FF含量成負相關(guān)(r=—0.8061,P=0.0000),與sLR、sRANKL含量無相關(guān)性(r=0.2970,P=0.1324;r=0.2197,P=0.2709)。3anfh患者的骨髓中開展氧自原代地區(qū)研究的意義瘦素是由肥胖基因編碼的一種分泌型蛋白質(zhì),相對分子質(zhì)量為16×103。主要由白色脂肪組織產(chǎn)生,此外棕色脂肪、骨骼肌、胎盤、骨軟骨組織也可分泌。白色脂肪組織分泌瘦素量與體內(nèi)脂肪含量成正比,并受神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)反饋調(diào)節(jié)。除了可以調(diào)節(jié)食欲與脂肪代謝外,瘦素在骨代謝中也發(fā)揮著重要作用。最近研究發(fā)現(xiàn),瘦素是骨髓中一種重要的旁分泌信號分子,在骨髓基質(zhì)細胞、成骨細胞和骨細胞中都有表達,因此其被認為可能是聯(lián)系脂代謝與骨代謝的重要因子。目前ANFH的發(fā)病機制還未完全闡明,眾多研究表明,脂質(zhì)代謝紊亂可能是ANFH的重要環(huán)節(jié)之一。各種因素所致的股骨頭內(nèi)脂肪細胞增生肥大、脂肪堆積、骨髓脂肪化,會最終導(dǎo)致骨內(nèi)壓升高,骨內(nèi)血管閉塞,缺血性骨壞死。瘦素是最近發(fā)現(xiàn)的一種脂肪因子,在機體食物攝入、脂肪儲存、能量消耗等方面進行中樞性調(diào)節(jié),同時在調(diào)節(jié)骨代謝中發(fā)揮重要作用。它一方面通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制成骨,促進骨吸收;另一方面通過外周作用促進骨形成。在局部微環(huán)境中以外周作用占主導(dǎo),但瘦素在骨代謝中的最終作用可能是上述兩個相反機制共同調(diào)節(jié)的結(jié)果。對于骨髓這個相對密閉的環(huán)境,測定局部瘦素含量比血清瘦素含量更能反映局部骨代謝變化,因此本研究選擇測量骨髓內(nèi)瘦素,以觀察其水平變化。越來越多研究表明,各種因素所致的局部微環(huán)境失調(diào)可能是導(dǎo)致骨髓脂肪變性的直接因素。在骨髓中成骨細胞系與成脂細胞系具有共同的前體細胞——BMSCs,微環(huán)境改變會破壞干細胞的分化平衡狀態(tài),導(dǎo)致向成脂細胞方向分化增多,向成骨細胞方向分化減少。作為一相對密閉的環(huán)境,骨髓中的各種細胞通過自分泌或旁分泌可溶性因子與細胞外基質(zhì)和激素一起維持骨髓微環(huán)境的穩(wěn)定。而調(diào)節(jié)信號的破壞會影響髓內(nèi)脂代謝與骨代謝平衡,進而引起相關(guān)骨代謝疾病。目前研究發(fā)現(xiàn),在BMSCs、成骨細胞和骨細胞表面均有瘦素受體表達,瘦素可以與瘦素受體結(jié)合,促進BMSCs向成骨細胞分化,抑制其向成脂細胞分化;同時可以促進成骨細胞的增殖成熟,促進礦化結(jié)節(jié)形成。而瘦素缺乏則會使脂肪細胞合成增加,脂肪組織可以分泌IL-1,促進破骨細胞活性,并抑制成骨細胞活性。本研究發(fā)現(xiàn),ANFH患者骨髓中的瘦素水平及其在局部微環(huán)境中的生物學(xué)活性較正常股骨頭均呈下降趨勢,瘦素水平與FF含量相關(guān),而兩組外周血血脂水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。說明瘦素在調(diào)節(jié)骨髓局部脂代謝中發(fā)揮重要作用,ANFH患者髓內(nèi)脂肪增多可能與髓內(nèi)瘦素生物學(xué)活性降低有關(guān)。同時與血清中瘦素相比,骨髓中瘦素的表達可能更恒定,并且可以更好地反映骨代謝情況,ANFH患者骨髓中瘦素的濃度通常在正常血清瘦素濃度范圍內(nèi)。有研究表明,當(dāng)瘦素缺失時,會伴有骨骼生長停滯,骨量減少,骨髓腔大量脂肪生成。這也說明了骨髓中瘦素表達的改變可能破壞骨-脂代謝平衡,導(dǎo)致骨重構(gòu)平衡失衡。據(jù)報道,激素與酒精可以造成骨髓內(nèi)炎性、成脂分化的環(huán)境,同時干擾脂肪因子代謝,使脂聯(lián)素和瘦素水平降低。我們認為瘦素表達降低后會引起骨髓微環(huán)境改變,進而影響B(tài)MSCs的分化能力,使其成脂分化能力增強,成骨能力減弱,使干細胞分化平衡左移。瘦素作為聯(lián)系脂代謝與骨代謝活動的關(guān)鍵因子之一,各種因素所致的瘦素表達水平變化均會影響骨髓微環(huán)境中骨-脂代謝平衡,而骨、脂代謝紊亂又會影響B(tài)MSCs分化進程,加重骨代謝紊亂,形成惡性循環(huán),最終發(fā)生骨壞死。同時本研究還發(fā)現(xiàn)