第3章 滅菌與空氣凈化

第一次作業(yè)1、什么是發(fā)酵？什么是發(fā)酵工程？2、簡述典型好氣性發(fā)酵的一般工藝流程第二次作業(yè)1、菌種選育具體有哪些方法？2、菌種保藏的原理是什么？有哪些方法？3、設計一個從自然界篩選產淀粉酶的高溫菌的實驗方案，詳細說明主要步驟。第三次作業(yè)1、種子擴大培養(yǎng)的一般流程是怎樣的？2、影響種子質量的因數(shù)有哪些？第3章滅菌與空氣凈化3.1滅菌滅菌：用物理或化學方法殺死或除去物料或設備中所有微生物，包括營養(yǎng)細胞、細菌芽孢和孢子。消毒：用物理或化學方法殺死空氣、容器內外及環(huán)境中的微生物，一般只能殺死營養(yǎng)細胞。除菌：用過濾的方法除去空氣或液體中的微生物及其孢子。3.1.1發(fā)酵工業(yè)常用的滅菌方法1、干熱滅菌法2、濕熱滅菌法3、射線滅菌法4、化學藥劑滅菌法5、過濾除菌法3.1.2濕熱滅菌原理1、微生物的熱阻

致死溫度：殺死微生物的極限溫度

致死時間：在致死溫度時，殺死全部微生物所需的時間

熱阻：指微生物在某一特定條件（溫度和加熱方式）下的致死時間

表3-1幾種微生物對濕熱的相對抵抗力微生物名稱大腸桿菌細菌芽孢霉菌孢子病毒相對抵抗力

130000002～101～52、微生物的熱死規(guī)律——對數(shù)殘留定律實驗證明，微生物營養(yǎng)細胞的均相熱死滅動力學符合化學反應的一級反應動力學，即：

（1）N：任一時刻的殘留的活菌數(shù)（個）t：滅菌時間（min）K：反應速率常數(shù)（min-1）取邊界條件t0=0，N=N0，對（1）積分得式中：N0為開始滅菌時原有活菌數(shù)（個），

Nt為經過t時間滅菌后的殘留菌數(shù)（個）

K為反應速率常數(shù)（min-1）由上式可知滅菌時間取決于污染程度N0、滅菌程度Nt和K值。①一般只考慮細菌的芽孢作為計算依據(jù)。②如果要求達到徹底滅菌，即Nt＝0則所需滅菌時間t∞，這在實際生產上不可行。在實際設計時常采用Nt＝0.001，即在1000批次滅菌中有一次失敗。③反應速率常數(shù)K是微生物耐熱性的一種特征，它隨微生物種類和滅菌溫度而異。相同溫度下，K值越小則微生物越耐熱。同一種微生物在不同滅菌溫度下，K值不同。滅菌溫度越低，K值越??；滅菌溫度越高，K值越大因此提高滅菌溫度，K值增大，滅菌時間顯著縮短。3.1.3培養(yǎng)基的滅菌1、培養(yǎng)基滅菌溫度和時間的選擇在化學反應的一級反應動力學類型中，當其他條件不變時，反應速率常數(shù)與溫度的關系可用阿倫尼烏斯（Arrhenius）方程表示：

由于雜菌死亡屬一級動力學反應，大部分培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的破壞為一級分解反應。在滅菌時，當溫度由T1升到T2，滅菌速率常數(shù)K和培養(yǎng)基成分破壞速率常數(shù)K’都變化。滅菌速率常數(shù)K值在T1、T2時分別為：將兩式相除并取對數(shù)得：

(1)

同樣，滅菌時培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的破壞也可得類似關系：

(2)將式（1）和式（2）相除得：由于殺死細菌芽孢的活化能E大于營養(yǎng)成分破壞的活化能E‘，因此>，即隨溫度升高，滅菌速率常數(shù)增加的倍數(shù)大于營養(yǎng)成分破壞速率常數(shù)增加的倍數(shù)，也就是說溫度升高，雜菌死亡速率大于培養(yǎng)基成分破壞的速率。達到相同的滅菌效果，提高滅菌溫度可明顯縮短滅菌時間，并減少培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的破壞，這就是通常說的“高溫短時滅菌法”。如將芽孢桿菌和維生素B2放在一起滅菌，當溫度維持118℃加熱15min，可殺死99.99%的細菌芽孢，維生素B2破壞率為10%；而在120℃時加熱1.5min，細菌芽孢死亡率仍為99.99%，而維生素B2破壞率為5%。2、培養(yǎng)基的滅菌方法（1）分批滅菌

也稱實消、實罐滅菌、間歇滅菌，是指將配制好的培養(yǎng)基輸入發(fā)酵罐內，直接通入蒸汽將培養(yǎng)基和所用設備一起進行滅菌的操作過程。在發(fā)酵罐中進行實罐滅菌，是典型的分批滅菌。全過程包括升溫、保溫、降溫三個過程。（2）連續(xù)滅菌也稱連消，指培養(yǎng)基在發(fā)酵罐外經過一套滅菌設備連續(xù)的加熱滅菌，冷卻后送入空消后的發(fā)酵罐的滅菌法。

連續(xù)滅菌的流程有3種：（a)噴射加熱連續(xù)滅菌流程(b)噴淋冷卻連續(xù)滅菌流程（c）薄板換熱器連續(xù)滅菌流程（3）固體培養(yǎng)基滅菌固體培養(yǎng)基也和液體培養(yǎng)基一樣，要先蒸煮滅菌，但固體培養(yǎng)基呈粒狀、片狀或粉狀，流動性差不易翻動，吸水加熱容易成團，冷卻困難。針對這些特點設計的轉鼓式滅菌機常用于酒廠、醬油廠。該設備能承受一定壓力，裝料后旋緊進出口蓋，就如同密封容器。轉鼓以0.5～1r/min徐徐轉動，培養(yǎng)基得到翻動，蒸汽沿軸心通入加熱培養(yǎng)基，達到一定溫度后進行保溫滅菌。滅菌完畢用真空泵沿空心軸抽真空，轉鼓內壓力降低，培養(yǎng)基冷卻。3、連續(xù)滅菌與分批滅菌的比較（1）連續(xù)滅菌的優(yōu)缺點優(yōu)點保留較多的營養(yǎng)質量容易放大較易自動控制；糖受蒸汽的影響較少；縮短滅菌周期；在某些情況下，可使發(fā)酵罐的腐蝕減少；發(fā)酵罐利用率高；蒸汽負荷均勻。缺點設備比較復雜，投資較大。（2）分批滅菌的優(yōu)缺點優(yōu)點設備投資較少染菌的危險性較小人工操作較方便對培養(yǎng)基中固體物質含量較多時更為適宜缺點滅菌過程中蒸汽用量變化大，造成鍋爐負荷波動大，一般只限于中小型發(fā)酵裝置。4、影響培養(yǎng)基滅菌的其他因素影響培養(yǎng)基滅菌除了所污染雜菌的種類、數(shù)量、滅菌時間和溫度外，培養(yǎng)基成分、pH值、培養(yǎng)基中顆粒、泡沫等對培養(yǎng)基滅菌也有影響。（1）培養(yǎng)基成分油脂，糖類及一定濃度的蛋白質可增加微生物的耐熱性，另一些物質，如高濃度的鹽類，色素等可削弱其耐熱性。（2）pH值培養(yǎng)基pH為6.0～8.0時，微生物耐熱性好，pH＜6.0時氫離子容易滲入微生物細胞內，從而改變細胞的生理反應促使其死亡，所以培養(yǎng)基的pH值越低，滅菌所需時間越短。（3）培養(yǎng)基的物理狀態(tài)顆粒小滅菌容易，顆粒大滅菌難。當培養(yǎng)基中有直徑大于1mm的顆粒物則明顯影響滅菌效果，蒸汽很難滲透到顆粒內部，稱為“滅菌不透”，應過濾除去。（4）泡沫泡沫中的空氣形成隔熱層，使傳熱困難，熱難穿透過去殺滅微生物。

（5）微生物細胞的含水量含水越多，微生物越易死亡（6）微生物細胞的菌齡菌齡越老則越不易死亡（7）空氣排除情況空氣排出越徹底，微生物越易死亡5、滅菌時間的計算（1）分批滅菌時間的計算【例3-1】

有一發(fā)酵罐內裝40m3培養(yǎng)基，在121℃進行實罐滅菌。原污染程度為每1mL有2×105個耐熱細菌芽孢，121℃時滅菌速率常數(shù)為1.8min－1。求滅菌失敗機率為0.001時所需的滅菌時間。有一發(fā)酵罐，內裝80m3培養(yǎng)基，在121℃溫度下進行實罐滅菌。設每毫升培養(yǎng)基中含有耐熱菌的芽孢數(shù)為1.25×107個，大腸桿菌為5×107個，霉菌為2.5×107

個121℃時滅菌速率常數(shù)為0.0287s－1。試求滅菌失敗幾率為0.001時所需的滅菌時間。（2）連續(xù)滅菌時間的計算【例3-2】若將例3-1中的培養(yǎng)基采用連續(xù)滅菌，滅菌溫度為131℃，此溫度下滅菌速率常數(shù)為15min－1，求滅菌所需的維持時間。3.2空氣凈化

一、空氣凈化的方法

1加熱滅菌

2靜電除塵

3介質過濾除菌二、空氣過濾除菌的原理和介質按照過濾除菌機理不同，過濾除菌分為：絕對過濾：塵?；騇直徑＞過濾介質孔徑相對過濾：塵埃或M直徑＜過濾介質孔徑這種相對過濾又稱為深層介質過濾。1、空氣過濾除菌的原理（1）布朗擴散作用（2）攔截作用（3）慣性碰撞（4）重力沉降（5）靜電吸引①當氣流速度較大時，慣性撞擊起主要作用，除菌效率隨氣流速度增加而上升②當氣流速度較小時，布朗擴散起主要作用，除菌效率隨氣流速度增加而降低③當氣流速度中等時，攔截起主要作用④當氣流速度過大時，已被捕集的微粒又被湍動的氣流夾帶返回氣流中，除菌效率下降

2、空氣過濾除菌的介質

（1）纖維狀或顆粒狀介質①棉花②玻璃纖維③活性炭這類過濾介質對0.3μm以下的顆粒過濾效率僅為99%，難以滿足工業(yè)發(fā)酵的無菌要求，需多次過濾。

缺點：體積大，占用空間大，操作困難，裝填介質費時費力且松緊度不易掌握，空氣壓力降大，介質滅菌和吹干耗用大量的蒸汽和空氣。深層棉花、活性炭過濾器的結構

（2）過濾紙類介質①超細玻璃纖維紙：這類介質過濾效果較好，對空氣的阻力和壓力降較小。缺點是強度不夠，特別是受潮后強度更差。②石棉濾板：優(yōu)點是濕強度大，受潮時不易穿孔或折斷，能耐受蒸汽反復殺菌，使用時間長。缺點是由于纖維直徑大，過濾效率不高，只適用于空氣分過濾器。③濾棒：

3.燒結材料類介質

燒結金屬、燒結陶瓷、燒結塑料等4.新型過濾介質①能除去全部M，但不能除去噬菌體的過濾介質，主要有膜孔小于0.22um的聚偏四氟乙烯（PVDF）和聚四氟乙烯（PTFE）膜材②能除去小至0.01um的微粒，可除去噬菌體，主要有Bio-X濾材和膨化聚四氟乙烯三、空氣過濾除菌的流程1、空氣的預處理：（1）空氣的粗濾（2）空氣的壓縮和穩(wěn)壓（3）壓縮空氣的冷卻（4）壓縮空氣除油除水（5）壓縮空氣的再加熱2、空氣凈化的一般流程：

空氣吸氣口粗過濾器空壓機貯罐

冷卻器分離器加熱器總過濾器

分過濾器無菌空氣（1）冷熱空氣直接混合的除菌流程（2）高效前置過濾器除菌流程空氣吸氣口粗過濾器高效前置過濾器

空壓機貯罐冷卻器分離器加熱器總過濾器（