酶工程：酶的分離

第四章酶的提取與分離純化預(yù)處理（pretreatment）：包括固液分離和細(xì)胞破碎（分離胞內(nèi)產(chǎn)物）等。初步純化（roughfractionation）（提?。撼ヅc目的產(chǎn)物性質(zhì)差異很大的雜質(zhì)。高度純化（finefractionation）（精制）：除去與產(chǎn)物性質(zhì)相似的雜質(zhì)。濃縮與干燥（concentrationanddesiccation）（成品加工）:使酶與溶劑分離的過程。

第一節(jié)酶的分離一、發(fā)酵液預(yù)處理(一)發(fā)酵液的相對(duì)純化1.無機(jī)離子的去除2.雜蛋白質(zhì)的去除3.色素及其他物質(zhì)的去除(二）發(fā)酵液的固液分離1.影響發(fā)酵液過濾的因素

1）菌種2）培養(yǎng)基組成2.提高過濾性能的方法

1）絮凝和凝聚

2）稀釋、加熱

3）加助濾劑，常用硅藻土等。

主要方法是離心分離和過濾二、細(xì)胞破碎

（一）細(xì)胞壁組成

細(xì)胞壁的主要成分：細(xì)菌：肽聚糖(N-乙酰萄糖胺，N-乙酰胞壁酸)

酵母：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白質(zhì)真菌:多糖（幾丁質(zhì)和葡聚糖）

微生物革蘭氏陽性細(xì)菌革蘭氏陰性細(xì)菌放線菌酵母菌霉菌壁厚/nm15~5010~13同G+100~300100~250層次單層多層多層多層主要組成肽聚糖(40%~90%)多糖胞壁酸蛋白質(zhì)脂多糖(1%?2%)肽聚糖(5%~10%)脂蛋白脂多糖(11%~22%)磷脂蛋白質(zhì)葡聚糖(30%~40%)甘露聚糖(30%)幾丁質(zhì)(1%~2%)蛋白質(zhì)(6%~8%)脂類(8.5%~13.5%)多聚糖(80%~90%)脂類蛋白質(zhì)各種微生物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與組成

細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)

酵母菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)

M—甘露聚糖；P—磷酸二酯鍵；G—葡聚糖

（二）細(xì)胞破碎的方法

機(jī)械法物理法化學(xué)法生物法（酶解）

1.機(jī)械法：

1）液體剪切：攪拌、勻漿。

2）固體剪切：研磨，珠磨，搗碎。2.物理法：

1）超聲波破碎法。

2）滲透壓突變法：高滲（蔗糖，高鹽等）平衡后迅速轉(zhuǎn)入低滲溶液或水中。

3）凍融法：反復(fù)低溫冰凍，室溫融化。3.化學(xué)法

應(yīng)用各種化學(xué)試劑與細(xì)胞膜作用，使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變或破壞。

1）有機(jī)溶劑處理：破壞膜磷脂結(jié)構(gòu)，常用丙酮、丁醇、氯仿等。

2）表面活性劑處理：常用非離子型表面活性劑，如TritonX-100，Tween等。4.酶解法（enzymaticlysis）：

外加酶法：根據(jù)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成特點(diǎn)，選用適當(dāng)?shù)拿浮?/p>

自溶法（autolysis）:

細(xì)胞結(jié)構(gòu)在本身具有的各種水解酶作用下發(fā)生溶解的現(xiàn)象。（三）細(xì)胞破碎確認(rèn)

1.直接測(cè)定破碎前后的細(xì)胞數(shù)：

破碎前，用顯微鏡或電子微粒計(jì)數(shù)器直接計(jì)數(shù)；破碎后，用染色法區(qū)分破碎細(xì)胞與完整細(xì)胞。

2.測(cè)定導(dǎo)電率：利用破碎前后導(dǎo)電率的變化測(cè)定破碎程度。

3.測(cè)定釋放的蛋白質(zhì)量或酶活力：測(cè)定破碎液中胞內(nèi)蛋白質(zhì)或目的酶的釋放量，估算破碎率。

三、酶的提取(extraction)

把酶從生物組織或細(xì)胞中以溶解狀態(tài)釋放出來的過程，即將盡可能多的酶，盡量少的雜質(zhì)從原料中引入溶液。

提取目標(biāo)：

a.將目的酶最大限度地溶解出來。

b.保持生物活性。注意：溫度升高，溶解度加大。但為防止酶失活，一般采用低溫下（0~10℃）操作。提取原則a.相似相溶。b.遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的pH值，溶解度增加。

提取方法：（一）鹽溶液提取

常用稀鹽（常用NaCl）溶液（鹽溶），對(duì)酶穩(wěn)定性好、溶解度大。

（二）酸、堿溶液提取（三）有機(jī)溶劑提取四、離心分離（一）基本原理1.離心力

Fc=mac

＝mr

ω2

＝mr

（2

N/60）2

N為離心機(jī)每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)（r/min）；

Fc通常以相對(duì)離心力RCF（relativecentrifugalforce）表示，即離心力F的大小相當(dāng)于地球引力（重力常數(shù)g）的多少倍。一般用g（或數(shù)字

g）表示。RCF=mr

（2

N/60）2/mg=1.12

10-5N2r

旋轉(zhuǎn)半徑用r平均代替r平均=1/2（r大+r?。ヽm

相對(duì)離心力與轉(zhuǎn)速的關(guān)系

通常：低速離心以每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)表示，如：4000r/min。高速離心（超速），常以相對(duì)離心力（RCF）表示，如：65000g。兩者可換算或查測(cè)算圖。計(jì)算近似RCF的列線圖2.沉降系數(shù):（sedimentationconstant）

指單位離心力下顆粒的沉降速度（sedimentationvelocity）,用S表示。由于許多生物大分子的S值很小，所以定義10

13s

為一個(gè)沉降單位，1S=1

10

13s。

常用S表示某些生物大分子、亞細(xì)胞及亞細(xì)胞器的大小，如16sRNA，蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)一般在1~200之間。

（二）離心機(jī)的種類按離心機(jī)轉(zhuǎn)速的不同，分為：常速（低速）高速超速

名稱

轉(zhuǎn)速(r/min)

注意事項(xiàng)

低速離心機(jī)

6000

常溫，注意樣品熱變性和離心管平衡

高速離心機(jī)

6000?25000冷凍（防止溫度升高），離心管的精確平衡

超速離心機(jī)

>25000冷凍＋真空系統(tǒng)（減少空氣阻力和摩擦），離心管的精確平衡

離心機(jī)的種類

實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)溫度類型：常溫及冷凍超速離心機(jī)均為冷凍型。使用冷凍離心機(jī)時(shí)提前降溫，預(yù)冷離心頭。使用超速離心機(jī)時(shí)先抽真空。離心的形式角式及外擺式：外擺式一般為低速，角式由低速到超速均有。角式離心機(jī)和離心頭（轉(zhuǎn)子）角式離心頭要配套，低溫使用要預(yù)冷，操作注意穩(wěn)、蓋、旋緊。離心機(jī)的大?。郝涞厥郊芭_(tái)式小臺(tái)式離心機(jī)離心管材質(zhì)：玻璃，塑料強(qiáng)度：和離心速度相配大?。汉娃D(zhuǎn)子配套高速超速管要加蓋離心機(jī)操作平衡、定溫、定速、定時(shí)。（三）常用離心方法

差速離心法沉降速度法密度梯度離心沉降平衡法等密度梯度離心1．差速離心

（differentialcentrifugation）

采用不同的離心速度和離心時(shí)間，使沉降速度不同的顆粒分批分離的方法。特點(diǎn)：用于分離大小和密度差異較大的顆粒。

優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單。缺點(diǎn)：1）分離效果較差，不能一次得到純顆粒。

2）壁效應(yīng)嚴(yán)重。

3）沉降的顆粒受到擠壓。

差速離心分離示意圖

（a）離心前的懸浮液（b）～（e）離心不同時(shí)間后顆粒的沉降情況

2．密度梯度離心

（densitygradientcentrifugation）

樣品在密度梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心，使密度接近的組分得以分離的一種區(qū)帶分離方法。

常用的密度梯度溶液是蔗糖溶液。特點(diǎn)：區(qū)帶內(nèi)的液相介質(zhì)密度小于樣品物質(zhì)顆粒的密度。適宜分離密度相近而大小不同的固相物質(zhì)。

密度梯度離心示意圖

（a）離心前（b）離心后

Densitygradientultracentrifugation密度梯度離心

步驟：A.形成密度梯度B.加樣C.離心D.收集樣品3.等密度梯度離心

又稱沉降平衡離心（sedimentationequilibriumcentrifugation）。根據(jù)顆粒的密度不同而進(jìn)行分離。離心時(shí)，在離心介質(zhì)的密度梯度范圍內(nèi)，不同密度的物質(zhì)顆粒或向下沉降，或向上漂浮，達(dá)到與其相同的密度時(shí)不再移動(dòng)，形成區(qū)帶。常用氯化銫（CsCl）作為梯度介質(zhì)。特點(diǎn)：

介質(zhì)的密度梯度范圍包括所有待分離物質(zhì)的密度。適于分離沉降系數(shù)相近，但密度不同的物質(zhì)。

等密度梯度離心示意圖

（a）離心前；（b）離心后

密度梯度離心等密度梯度離心梯度介質(zhì)常用蔗糖最大的梯度密度<最小密度的沉降樣品常用CsCl最大的梯度密度>密度最大的沉降樣品離心條件在最前的沉降物質(zhì)達(dá)到管底前停止，短時(shí)間，低速度使各組分沉降到其平衡的密度區(qū)，長(zhǎng)時(shí)間，高速度分離依據(jù)密度相近，但沉降系數(shù)不同沉降系數(shù)相近，但密度不同沉降速度離心和沉降平衡離心的特點(diǎn)總結(jié)：等密度梯度離心是一種測(cè)定顆粒浮力密度的靜力學(xué)方法，關(guān)鍵在于選擇氯化銫濃度，使之包括待分離物的密度范圍。差速離心是一種動(dòng)力學(xué)方法，關(guān)鍵在于選擇適合于各分離物的離心力。密度梯度離心兼有以上兩種方法的特點(diǎn)，關(guān)鍵在于制備優(yōu)質(zhì)的密度梯度溶液。（四）應(yīng)用根據(jù)不同離心目的，分為制備性離心：分離純化和制備分析性離心：

測(cè)分子量、沉降系數(shù)、密度、純度五、沉淀分離（根據(jù)溶解度的不同）使溶液中的溶質(zhì)由液相轉(zhuǎn)變?yōu)楣滔辔龀龉爬稀?shí)用、簡(jiǎn)單的初步分離方法在生物大分子制備中最常用的幾種沉淀方法：

⑴中性鹽沉淀（鹽析法）

⑵有機(jī)溶劑沉淀

⑶選擇性沉淀（熱變性和酸堿變性）

⑷等電點(diǎn)沉淀

⑸有機(jī)聚合物沉淀（一）鹽析沉淀法（改變離子強(qiáng)度）1.基本原理（鹽溶和鹽析）

向蛋白質(zhì)或酶的水溶液中加入中性鹽，可產(chǎn)生兩種現(xiàn)象：

1)鹽溶（saltingin）：低濃度的中性鹽增加蛋白質(zhì)的溶解度。

2)鹽析（saltingout）：高濃度的中性鹽降低蛋白質(zhì)的溶解度。蛋白質(zhì)的鹽析硫酸銨對(duì)馬血紅蛋白的溶解度的影響離子強(qiáng)度鹽析鹽溶

原因：高鹽濃度下鹽離子與蛋白質(zhì)分子爭(zhēng)奪水分子，除去蛋白質(zhì)的水合外殼，降低溶解度而沉淀。不同蛋白質(zhì)分子量、表面電荷不同，在不同鹽濃度下沉淀，逐漸增大鹽濃度，不同蛋白質(zhì)先后析出，稱分段鹽析。蛋白質(zhì)分子表面的疏水區(qū)域和荷電區(qū)域

1）中性鹽的選擇常用（NH4）2SO4，其突出優(yōu)點(diǎn)：

a.溶解度大

b.分離效果好

c.不易引起變性

d.價(jià)格便宜2.鹽析用鹽2)鹽濃度的表示用飽和（溶解）度表示:

溶液中飽和硫酸銨的體積飽和度＝溶液的總體積3)調(diào)整鹽濃度的方式

a.飽和溶液法（添加飽和硫酸銨溶液）適用于：蛋白質(zhì)溶液體積不太大，而達(dá)到的鹽濃度又不太高時(shí)。配制飽和硫酸銨溶液所需添加飽和硫酸銨的體積可按下式計(jì)算：

S2-S1V=V0————1-S2式中V,V0——分別為所需加入的飽和硫酸銨體積及原溶液體積S2,S1——分別為所需達(dá)到的硫酸銨飽和度和原來溶液的硫酸銨飽和度b.添加固體硫酸銨適用于：蛋白質(zhì)溶液原來體積已經(jīng)很大，而要達(dá)到的鹽濃度又很高時(shí)。按下式計(jì)算，得表中數(shù)據(jù)

B(S2-S1)W=——————1-AS2A,B——常數(shù)，與溫度有關(guān)。實(shí)際使用時(shí)，可直接查表（各種飽和度下需加固體硫酸銨的量）。調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計(jì)算表鹽析操作低飽和度：飽和溶液滴加法。易于迅速混合均勻，一般終飽和度不超過40％。高飽和度：固體鹽添加法。不會(huì)大量增加溶液體積。1）固體硫酸銨充分研細(xì)，溫和攪拌中緩慢加入。2）冰箱中（4℃）放置過夜，待沉淀完全后高速離心。3）沉淀再溶解后可用超濾（ultrafiltration）、透析（dialysis）或?qū)游觯╟hromatography）方法脫鹽。3.鹽析曲線的制作

如要分離一種新的蛋白質(zhì)和酶，應(yīng)先確定沉淀該物質(zhì)的硫酸銨飽和度。蛋白質(zhì)量(mg)或酶活力

102030405060708090100硫銨飽和度％

硫酸銨濃度（%）枯草桿菌

-淀粉酶發(fā)酵液的鹽析曲線

4.鹽析的影響因素1)離子強(qiáng)度和種類（介紹鹽析常數(shù)）蛋白質(zhì)溶解度與鹽濃度之間的關(guān)系：Ks：鹽析常數(shù)，是與蛋白質(zhì)和鹽種類有關(guān)的特性常數(shù)。

Ks代表鹽析效率，其含義是隨著鹽濃度的增加，蛋白質(zhì)溶解度降低的速度，Ks越大鹽析效果越好。

當(dāng)溫度一定時(shí)，S0對(duì)于某一溶質(zhì)是常數(shù)，用β表示，鹽析方程式可改寫為：

logS=β-KsI

兩種鹽析法：Ks分級(jí)鹽析法：在一定的pH和溫度條件下，利用不同蛋白質(zhì)Ks的不同，通過改變離子強(qiáng)度或鹽濃度（即改變I值）的沉淀方法。β分級(jí)鹽析法：在一定離子強(qiáng)度下，通過改變?nèi)芤旱膒H及溫度的沉淀方法。2)蛋白質(zhì)濃度：過稀回收沉淀困難，過濃易共沉淀，2.5%-3%最好。3)pH值：等電點(diǎn)處最易沉淀。4)溫度的影響：稀鹽溶液中，溫度升高蛋白質(zhì)溶解度提高。濃鹽溶液中，溫度升高蛋白質(zhì)溶解度下降。一般可在室溫下進(jìn)行。某些對(duì)溫度敏感的酶，可在0℃～4℃下操作。（二）有機(jī)溶劑沉淀（降低介電常數(shù)）1.沉淀機(jī)理

降低溶液的介電常數(shù)部分地引起蛋白質(zhì)脫水2.常用有機(jī)溶劑丙酮

乙醇

甲醇，用量一般為酶液體積的2倍左右，終濃度為70%。

3.優(yōu)缺點(diǎn)：

優(yōu)點(diǎn)：1）分辨率比鹽析法高

2）沉淀不需脫鹽

3）溶劑易蒸發(fā)，沉淀易離心缺點(diǎn)：容易引起蛋白質(zhì)變性失活。

4.影響有機(jī)溶劑沉淀的因素（1）溫度：低溫（0℃）操作。（2）pH值：盡可能靠近其等電點(diǎn)。（3）離子強(qiáng)度：采用<0.05mol/L的稀鹽溶液（4）蛋白質(zhì)濃度：適當(dāng)，一般為5?20mg/ml（三）等電點(diǎn)沉淀(isoelectricprecipitation)

1.原理:蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低不同的蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)

2.使用方法單獨(dú)使用較少（用于除雜蛋白），多與其它方法聯(lián)合使用（如鹽析法、有機(jī)溶劑法）。因?yàn)椋旱鞍踪|(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)仍有一定的溶解度。

（四）有機(jī)聚合物沉淀法

1.作用機(jī)理：與有機(jī)溶劑類似。2.沉淀劑：多用分子量為6000～20000的聚乙二醇（Polyethyeneglycol，簡(jiǎn)寫PEG

）。3.優(yōu)點(diǎn)：①操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。②沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相當(dāng)多的生物大分子。

（五）選擇性變性沉淀法選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜蛋白質(zhì)變性沉淀而不影響所需蛋白質(zhì)的方法。

⑴熱變性幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固，加熱升高溫度使雜蛋白變性沉淀而保留目的物在溶液中。

⑵pH變性等電點(diǎn)沉淀法是pH變性法中的一種變體。

⑶有機(jī)溶劑變性使那些對(duì)有機(jī)溶劑敏感的雜蛋白變性沉淀。六、萃?。╡xtraction）分離

利用溶質(zhì)在互不相溶的兩相之間分配系數(shù)的不同而使溶質(zhì)得到純化或濃縮的方法。特點(diǎn)：1）比化學(xué)沉淀法分離程度高2）比離子交換法選擇性好、傳質(zhì)快3）比蒸餾法能耗低

（一）溶劑萃取法明確幾個(gè)概念：料液：供提取的溶液。

溶質(zhì)：料液中欲提取的物質(zhì)。萃取劑：用來進(jìn)行萃取的溶劑，通常是有機(jī)溶劑。萃取液：經(jīng)接觸分離后，溶質(zhì)轉(zhuǎn)移到萃取劑中與萃取劑形成的溶液。萃余液：被萃取出溶質(zhì)后的料液。反萃取（backextraction）：完成萃取操作后，將產(chǎn)物從有機(jī)相轉(zhuǎn)入水相的萃取操作。

普通有機(jī)溶劑萃取難以進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離，

因?yàn)?1）蛋白質(zhì)親水性，不溶于有機(jī)溶劑2）蛋白質(zhì)在有機(jī)相中易變性失活故溶劑萃取法一般僅用于抗生素等小分子生物物質(zhì)的提取。

萃取操作的3個(gè)步驟：

1）混合

2）分離

3）溶劑回收單級(jí)萃取使用一個(gè)混合器和一個(gè)分離器

單級(jí)萃取流程93（二）雙水相萃取技術(shù)

又稱水溶液兩相分配技術(shù)（partionoftwoaqueousphasesystem）

用兩種不相溶的親水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（Dextran）進(jìn)行萃取。由于形成的兩相均有很高的含水量（達(dá)70%?90%），故稱“雙水相”系統(tǒng)。

優(yōu)點(diǎn)：1）每一水相中均有很高的含水量，為酶等生物物質(zhì)提供了一個(gè)良好的環(huán)境；2）PEG、Dextran和無機(jī)鹽對(duì)酶等無毒害作用，不會(huì)引起變性。

雙水相的形成：

兩種不同水溶性聚合物濃度達(dá)到一定值時(shí)，體系會(huì)自然地分成互不相容的兩相，構(gòu)成雙水相體系。

a雙節(jié)線系線b雙節(jié)線均相區(qū)均相區(qū)兩相區(qū)兩相區(qū)系線臨界點(diǎn)PEG/Dx和PEG/KPi系統(tǒng)的典型相圖

幾種典型的雙水相系統(tǒng)聚丙二醇聚乙二醇、聚乙烯醇葡聚糖（Dex）羥丙基葡聚糖聚乙二醇（PEG）葡聚糖（Dex）硫酸葡聚糖鈉鹽聚丙烯乙二醇羧基甲基葡聚糖鈉鹽甲基纖維素聚乙二醇（PEG）

磷酸鉀、硫酸銨硫酸鈉、硫酸鎂2.萃取原理：

利用生物物質(zhì)在雙水相體系中的選擇性分配。3.應(yīng)用

胞內(nèi)酶的提取和精制:

除去細(xì)胞碎片，并使酶得到純化。

幾種典型的雙水相萃取酶蛋白實(shí)例酶菌種相系統(tǒng)延胡索酸酶Brevibacteriumsp.PEG/鹽天冬氨酸酶E.coliPEG/鹽

-半乳糖苷酶E.coliPEG/鹽亮氨酸脫氫酶Bacillussp.PEG/Dex乙醇脫氫酶Baker’syeastPEG/鹽青霉素?；窫.coliPEG/鹽

雙水相萃取法的重要研究方向

——親和萃?。ㄓH和分配）

使用具有生物特異性的配基（ligand）來提高分離選擇性。

親和萃取酶實(shí)例

蛋白質(zhì)配基胰蛋白酶胰蛋白酶抑制劑磷酸果糖激酶三嗪染料甲酸脫氫酶三嗪染料葡糖-6-磷酸脫氫酶三嗪染料（三）超臨界流體萃取

兼有蒸餾和溶液萃取的特征，與常規(guī)溶劑萃取的區(qū)別：將超臨界流體作為萃取劑。

超臨界流體(supercriticalfluid，SCF）：超過氣液共存時(shí)的最高壓力和最高溫度下物質(zhì)特有的點(diǎn)——臨界點(diǎn)后的流體。

臨界點(diǎn)的概念可用臨界溫度和臨界壓力解釋：臨界溫度：高于此溫度時(shí)，無論加壓多大也不能使氣體液化。臨界壓力：在臨界溫度下，液化氣體所需要的壓力。

SCF性質(zhì)介于液體和氣體之間：1)SCF密度接近于液體，溶解度高。2)SCF粘度和擴(kuò)散系數(shù)接近于氣體，傳質(zhì)擴(kuò)散快。基本過程：1）在SCF中，溶解度大的物質(zhì)溶于其中，與不溶解或溶解度小的物質(zhì)分開。2）降低壓力，使SCF變?yōu)闅鈶B(tài)（密度降低），溶解物質(zhì)能力下降，萃取物與溶劑分離。常用超臨界液態(tài)CO2作為萃取劑，

因?yàn)椋?）液體CO2無毒2