生物催化與生物轉化I

生物催化與生物轉化第一章概論一微生物的多樣性和微生物資源的開拓1微生物的生境：指微生物在自然界中存在的場所，包括土壤、水域、動物、植物、極端環(huán)境、特殊環(huán)境和大氣2多樣性的廣度人們在實驗室所設計的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件還不能重復生境中的條件3原核生物是未曾觀察到的多數(shù)分布、數(shù)目和組分：原核生物的數(shù)目估計為〔4-6〕×1030個細胞，含碳量是植物含碳量的60%-100%4活的但不能夠培養(yǎng)的微生物長時期低溫保存在無營養(yǎng)料的鹽水中的霍亂弧菌和大腸桿菌5的菌種來源和菌種保藏中心二改進培養(yǎng)方法和尋找新類型微生物及其產物1新類型微生物的別離取樣預處理選擇性培養(yǎng)基上別離培養(yǎng)例如；抗生素生產菌的開展趨勢放線菌細菌霉菌真菌極端環(huán)境和特殊環(huán)境中的微生物藻類2富集培養(yǎng)樣品富集培養(yǎng)活的菌株純化菌株別離菌種所需菌種產品3代謝產物的篩選〔1〕篩選的要求；建立專一性的模型，操作簡便，能進行高通量篩選〔2〕篩選方法抑制細菌細胞壁的合成：內酰胺酶抑制劑；以細胞壁模擬三肽逆轉糖肽抗生素，從而篩選新的抗生素抑制真菌的抗生素：根據(jù)真菌細胞壁合成篩選抑制劑根據(jù)代謝途徑的有無而設計篩選方法殺蟲、殺螨、殺球孢蟲抗生素除草劑：以枯草桿菌為模型，在合成培養(yǎng)基中菌的生長受到抑制，但在谷氨酰胺存在時不受抑制酶抑制劑和生理活性物質血管緊張肽原血管緊張肽I血管緊張肽酶原血管緊張肽II血管緊張肽受體血管收縮治療愛滋病：篩選抑制愛滋病毒復制的HIV核糖核酸酶抑制劑腫瘤篩選的兩種模型：以DNA拓撲異構酶為靶酶的模型；DNA損傷修復系統(tǒng)中的抑制劑模型二生境中微生物基因組DNA的開拓1從土壤和水樣提取DNA及多樣性研究

16SrRNA序列分析得到的系統(tǒng)進化樹從生境中取樣：能代表自然環(huán)境中的多樣性微生物2土壤微生物DNA的文庫構建步驟土壤偏基因組DNABAC載體轉化E.coli本卷須知：〔1〕偏基因組文庫：土壤微生物群體的基因組〔2〕系統(tǒng)進化樹的比較分析：基因水平和氨基酸水平〔3〕從文庫中篩選生物活性物質〔4〕組合生物合成〔5〕聚酮體化合物第二章微生物工程的開展與趨向一微生物工程開展的幾個里程碑抗生素工業(yè)生產帶動了生化工程的建立大罐無菌深層發(fā)酵生物轉化的興起可的松類激素的合成〔黑根霉〕微生物發(fā)酵生產氨基酸谷氨酸、賴氨酸固定化技術補充：固定化酶和固定化細胞的差異蛋白酶抑制劑和其他酶抑制劑50多種具有專一性和特殊結構的蛋白酶、多肽酶等抑制劑基因工程技術大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、面包酵母、畢赤酵母、漢遜酵母菌、黑曲霉、乳酸菌二微生物代謝產物的類型初級代謝產物：氨基酸、核苷酸、維生素、有機酸、脂肪酸、乙醇次級代謝產物：抗生素、毒素、胞外多糖、植物堿轉化產物：甾體、烷烴、芳烴、雜環(huán)化合物三微生物工程面臨的形勢微生物工程與化學合成工業(yè)的競爭農業(yè)生物工程對微生物工程與化學工業(yè)的沖擊四微生物工程的開展方向提高現(xiàn)有微生物發(fā)酵工業(yè)水平〔1〕抗性菌株的選育〔2〕前體的應用〔3〕增加合成操縱子拷貝〔4〕關鍵基因的過量表達利用重組DNA技術內酰胺類抗生素、蝦青素、孕烯醇酮和孕甾酮開拓極端酶古細菌的菌種中存在新的代謝途徑，可能產生具有新的活力和用途的酶。第2章生物轉化操作與轉化反響類型一、生物轉化的一般操作1生物轉化的催化劑生長中的菌體休止菌體酶固定化酶固定化菌體2生物轉化的特點反響專一性區(qū)域專一性立體專一性

3操作步驟4矛盾的解決誘導酶基因工程菌二生物轉化反響的類型甾體的生物轉化第一個應用于工業(yè)生產的生物轉化紫蘿酮的羥基化：光學活性2-羥基胡蘿卜素合成的起始原料烷烴的雙端氧化：通過突變，可使氧化受阻，獲得烷烴的雙端氧化氧化脫氨：轉化頭孢菌素C為7-氨基頭孢烷酸所依據(jù)的反響，包括D-氨基酸氧化脫氨，所產生的酮基中間產物，再經細菌?；傅淖饔?，最后產生7-ACA。環(huán)氧化反響C-C鍵的脫氫：多不飽和脂肪酸的生產碳鏈氧化降解：降解甾體物質側鏈的一個重要反響，可用于制備天然芳香物質。碳雙鍵加水反響〔1〕采用固定化的Aspergilluswentii中丁烯二酸酶催化反丁烯二酸產生蘋果酸，產量達237g/L,轉化率為82%。〔2〕采用Rhizobium催化立體專一性加水反響生產治療心臟病藥物L-肉堿，產量達300g/L,轉化率為95%碳雙鍵加氨腈水化酶脫氨用?；干镛D化茚為1,2羥基茚：AIDS蛋白酶抑制劑的半合成局部結構

第三章膽固醇合成抑制藥物的生物轉化一膽固醇合成抑制劑的作用機制1膽固醇生物合成途徑2常見的膽固醇合成抑制劑HMG-CoA復原酶抑制劑：洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀對復原酶有競爭性抑制作用二4種膽固醇合成抑制劑的合成途徑三美伐他汀生物轉化為普伐他汀Hosobuchi等采用S.carbophilusSANK6285轉化美伐他汀存在底物的誘導〔羥基化活力〕和抑制作用。Matsuoka等觀察到美伐他汀轉化為普伐他汀是由細胞色素P450催化。四用ActinomaduraSP.進行轉化五辛伐他汀的生物轉化高濃度抑制產物形成營養(yǎng)養(yǎng)料第四章內酰胺抗生素母核的生物轉化16-APA的生成大局部的半合成青霉素由6-APA合成，后者主要由酶法或化學法降解青霉素而來。化學法和酶法相比，酶法更具有優(yōu)越性，使用的酶為青霉素酰化酶，又稱青霉素酰胺酶，按照優(yōu)先水解青霉素的能力又分為：青霉素G?；福嗝顾豓?；负桶逼S青霉素酶?！睞〕產生菌及其培養(yǎng)和性質PGA最常用于工業(yè)化生產的是大腸桿菌、巨大芽孢桿菌、淡紫灰鏈霉菌、無色桿菌、游動放線菌、產黑假單孢菌和產黃青霉菌。廣泛應用的大腸桿菌一般培養(yǎng)基含營養(yǎng)肉湯、玉米浸出液、胨、葡萄糖和苯乙酸。PGA的底物專一性非常寬。PVA主要由曲霉和Epidermophytoninterdigitale產生，屬于胞內酶氨芐青霉素酰化酶主要由假單孢菌屬生產〔B〕育種與基因工程多年來主要靠傳統(tǒng)誘變技術處理?；蚬こ叹甑臉嫿ㄊ峭ㄟ^改變調節(jié)區(qū)域的堿基、SD與ATG之間的距離提高PGA的表達水平，PGA的表達是溫度敏感型的，受葡萄糖阻遏和苯乙酸誘導，受細胞生長速度的影響。〔C〕PGA和PVA基因的表達和翻譯加工底物青霉素G的疏水側鏈結合位點是A亞基的Met168區(qū)域；催化位點在B亞基的Ser290。2青霉素?；傅募兓盁岱€(wěn)定性3青霉素?；傅墓潭ɑ潭ɑ删S持高活力和專一性，控制污染，還可長期使用。5日本旭化成公司固定化?；ㄉa6-APA巨大芽孢桿菌B-400的該酶能水解青霉素G苯乙酰7-ADCA、阿莫西林Cephalexin、Cephalothin，但不能水解青霉素V。固定化的方法菌株肉湯培養(yǎng)基中36度培養(yǎng)30-40小時用醋酸調pH6.0CeliteNo560吸附硫酸氨沉淀Sephadex凝膠脫鹽固定于胺化多孔聚丙烯腈6固定化菌體用于APA的生產菌種改進和培養(yǎng)條件優(yōu)化細胞固定化技術：多種固定化材料進行比較以殼聚糖最好。運轉的穩(wěn)定性：采用分批攪拌反響器固定化基因工程菌株7國內青霉素G?；干a6-APA的工藝和設備利用固定化基因工程改造的大腸桿菌轉化青霉素G：活力仍需誘導，受葡萄糖阻遏，對溫度敏感利用巨大芽孢桿菌的固定化酶進行轉化：采用對流控制的模式操作，縮短了反映器內的裂解反響時間，采用聚砜中空纖維膜和平板膜二7-氨基脫乙酰氧基頭孢烷酸〔7-ADCA〕和7-氨基頭孢烷酸〔7-ACA〕的生產1、7-ACA和7-ADCA是半合成頭孢菌素的母核，前者由青霉素G和青霉素V經青霉素酰化酶脫去側鏈而來，后者由7-苯乙酰胺脫乙酰氧基頭孢烷酸或7-苯氧乙酰胺脫乙酰氧基頭孢烷酸脫區(qū)側鏈而來。2、固定化青霉素?；干a7-ADCA3、直接發(fā)酵生產7-ADCA荷蘭的Gist-Brocades公司在1994年申請了兩項專利，提供生產7-ACDA的方法三酶法轉化頭孢菌素C為7-ACA半合成抗生素是一類高效、廣譜抗生素，內酰胺類抗生素的銷售值占抗生素總量的78.3%,其中頭孢霉素又占了70%,年消耗量早1600-2000噸之間.頭孢菌素類抗生素的前體為7-ACA.我國生產的第一個品種頭孢噻吩后,先后研制了11各品種,實際生產品種僅有8種,但處于產量小、品種少、70%依賴進口的狀態(tài)。半合成頭孢菌素抗生素的母核7-ACA的生產是開展這類抗生素的主要原料，其起始合成的物質為頭孢菌素C化學裂解法：主要方法，工藝成熟，7-ACA的收率在80%以上，但所使用的劇毒化學品、超低溫等條件，必然提高能耗和設備要求一步法轉化CPC生成7-ACA的研制一步裂解法需要CPC?；?，多數(shù)產生菌從土壤中別離，但是活力均比較低。許多人試圖通過對野生型的CPC酰化酶進行蛋白質工程改造來提高它對CPC的酶解活力，同時增加它的表達量。例如使CPC?；傅?69位的甲硫氨酸變?yōu)槔野彼幔?05位的半胱氨酸變?yōu)榻z氨酸，可使活力提高60%且表達量升高2-3倍對CPC?；高M行純化和固定化兩步法轉化CPC生成7-ACA的研制D-氨基酸氧化酶脫氨、脫羧；GL-7-ACA?；该撊ノ於；?〕DAO的存在，固定化及副反響微生物來源的DAO與FAD結合比較牢固，在工業(yè)上有良好的應用前景。DAO易失活，細胞內的穩(wěn)定性較高，經透性化處理的三角酵母細胞通過戊二醛和殼多糖相連，可以用于轉化。采用多孔性的樹脂固定化純化的DAO酶表觀活力很高。副反響的干擾DAO基因的克隆，不同表達系統(tǒng)的表達和在CPC轉化中的應用GA宿主菌的改造和發(fā)酵條件的優(yōu)化大多數(shù)產生GA的野生型假單孢菌屬于G-，產酶頂峰一般出現(xiàn)在對數(shù)生長末期，屬胞內酶。野生型產生菌活力較低，可經誘變、篩選獲得高產和組成型菌株。GA基因工程菌發(fā)酵條件優(yōu)化〔1〕溫度〔2〕補料：流加補糖；定時補充低濃度的葡萄糖〔3〕調節(jié)pH和通氣量〔4〕高密度發(fā)酵DAO與GA產生菌細胞對CPC實行共轉化DAO產生菌與GA工程菌的細胞共固定對CPC實行共轉化DAO與GA兩酶共固定化對CPC實行共轉化兩酶基因在同一宿主中克隆、表達并對CPC實行共轉化直接發(fā)酵生產7-ACA的基因工程菌的構建努力構建產黃頂孢霉或產黃青霉基因工程菌直接發(fā)酵生產7-ACA提高關鍵酶的基因劑量，增加合成CPC的產量。Conder等人的方法7-ACA合成的關鍵技術通過透性化、pH和加熱等細胞預處理方法提高了三角酵母DAO的表觀活力，并消除了過氧化氫酶、酯酶等雜酶的干擾。通過宿主菌染色體上的ampC基因鈍化而克服了內酰胺酶的破壞作用。成功解決了CPC發(fā)酵提煉精制液直接用于酶促轉化的關鍵問題在線控制與檢測第五章長鏈二元酸的生物轉化正構烷烴發(fā)酵生產單一長鏈二元酸合成麝香類物質單一長鏈二元酸是高級麝香型香料、醫(yī)藥、合成纖維、工程塑料的中間體原料?；瘜W合成具備一定的困難，1972和1978年日本科學家報道采用陰溝假絲酵母合成二元酸，16碳二元酸最高得率為54g/L.我國采用熱帶假絲酵母誘發(fā)多倍體突變株，其中休止細胞轉化最高產量可達109g/L。以單一長鏈二元酸作為中間原料，經2-4步化學反響可合成各種類型名貴的麝香型香料和藥品。要研制單一長鏈二元酸，國內外無現(xiàn)存原料、菌種和工藝，需要解決的問題主要有：單一正構烷烴的別離篩選對各種長度碳鏈都有氧化能力的菌種尋找適合工業(yè)化生產、得率高的發(fā)酵條件和轉化條件單一二元酸合成麝香型香料藥物的反響路線正構烷烴的蒸餾用單管精餾塔對錦西石油六廠出品的12-18碳的混合油為原料進行精餾，收集各種單一純烷烴，純度在95%以上，回收率在80%左右。單一長鏈二元酸生產菌株的篩選和轉化工藝熱帶假絲酵母多倍體誘變育種N-26號0.2%秋水仙堿28度振蕩48h屢次別離獲得的穩(wěn)定菌株亞硝基胍0度處理40分鐘高產突變株獲得的多倍體高產突變株十五碳二元酸最高產量可達77.2g/L,油的轉化率在60%以上。休止細胞轉化工藝正構烷烴發(fā)酵二元酸的調節(jié)過量的尿素對酵母的氧化酶系、異檸檬酸脫氫酶、異檸檬酸裂解酶、琥珀酸脫氫酶以及過氧化物酶有顯著促進，對氧化酶有顯著抑制。用單一長鏈二元酸化學合成麝香型香料麝香T〔十三碳二羧酸乙二醇酯〕合成經濟效果及其意義由正構烷烴生產單一長鏈二元酸合成麝香類物質的研究工作開始于1972年，到80年代已經成熟。其獨特之處在于：菌種產酸率高：通過多倍體誘變育種獲得的菌株對奇數(shù)和偶數(shù)烷烴都有很強的氧化產酸能力。休止細胞轉化工藝操作簡便，產品純度高單一長鏈二元酸用途廣泛，富有生命力〔1〕過去都要從油篩油脂中提取短碳化合物，再將碳鏈接長，不僅工藝復雜，而且需要大量溶劑及有毒物質，不適宜于工業(yè)化生產。〔2〕轉化方法優(yōu)于天然原料的化學合成，附加值高采用單管式和多管式填料精餾塔在減壓條件下先分餾得到各種餾分正烷烴，然后再按需要分別發(fā)酵生產不同長度的單一二元酸正構烷烴發(fā)酵生產長鏈二元酸長鏈二元酸的來源〔1〕植物油裂解制取〔2〕化工方法合成制取化學氧化時正烷烴發(fā)生斷鏈得不到和正烷烴相應鏈長的單一二元酸，所以很難用化工方法從石油中的正構烷烴直接氧化制取?！?〕生物工程技術生產微生物具有一種特異的氧化能力，通過胞內酶的作用，可在常溫常壓下，氧化石油中的正構烷烴的兩端兩個甲基，一步加上4個氧原子，生成與基質正烷烴相應鏈長的各種長鏈二元酸；此外微生物也能氧化脂肪族醇、酸和酯，生成相應鏈長的飽和或不飽和二元酸。國內外長鏈二元酸的研究概況根底理論研究階段：1970年以前，W-氧化應用研究階段：從正烷烴制取長鏈二元酸的研究有了新的突破，進入了應用研究階段。工業(yè)生產階段：20世紀80年代以后生產菌株的誘變篩選C10以上的長鏈二元酸，天然存在的少，化工上難以合成所有野生菌株都難以積累和基質鏈長相同的長鏈二元酸，它們的氧化能力，即對二元酸的降解能力太強。菌種誘變〔1〕亞硝基胍〔2〕紫外線照射處理〔3〕亞硝酸鈉處理〔4〕多倍體誘變育種〔5〕N+離子注入誘變處理〔6〕構建基因工程菌菌種篩選代謝調控微生物氧化正烷烴生產二元酸是胞內酶的作用。B氧化的抑制：丙烯酸，尿素W氧化的促進作用：青霉素引起細胞膜透性的變化；苯巴比妥和巴比妥酸鈉、維生素B12和吐溫等對提高二元酸的產量有較好促進作用。擴試和中試工業(yè)生產試驗和工業(yè)化生產長鏈二元酸發(fā)酵的特點四相體系發(fā)酵：菌體、空氣、烴類、水需要氧和發(fā)熱量大長鏈二元酸在水中溶解度小發(fā)酵工藝和條件攪拌速度pH控制溶解氧罐壓控制溫度控制補料二元酸的別離提取方法水中沉淀結晶醇中沉淀結晶溶劑中沉淀結晶有待解決的問題理論研究和應用研究通過基因工程方法構建氧化阻斷型和W氧化擴大型工程菌，再通過發(fā)酵過程的計算機優(yōu)化控制，進一步提高二元酸產量、降低生產本錢仍是努力方向。生產研究〔1〕發(fā)酵罐的放大〔2〕能源的消耗問題〔3〕價廉高效的乳化劑第六章組合生物合成定義在微生物次生代謝產物生物合成基因和酶學研究根底上形成的，對許多參與次生代謝生物合成的單個分開的具明顯的功能區(qū)域所組成的多酶體系進行替換、阻斷、重組等均有可能改變生物合成途徑而產生新的代謝旁路，形成新的化合物，設R為可利用的基因數(shù)，N為每個基因的不同等位形式，從理論上講可得到RN個化合物。例子放線紫紅素生物合成的C6位的羥基化酶基因在曼得霉素產生菌異源宿主菌中獲得了表達，將原榴菌素吡喃環(huán)H原子立體構型變成放線紫紅素中吡喃環(huán)的手性構型。將碳霉素產生菌異戊?；D移酶克隆至螺旋毒素產生菌，報道獲得了4``-異戊酰螺旋霉素化合物,日本學者將該基因克隆至泰洛菌素產生菌，產生4``-異戊酰泰洛菌素。結構不同、但生物合成途徑相似的抗生素生物合成基因之間，可以進行重組、組合或互補產生新結構的化合物對一些次級代謝產物生物合成酶系結構和功能的深入研究及分子生物學技術的開展，使得有可能對這些多酶體系進行重組改造及協(xié)調，促使組合生物合成這一創(chuàng)制新化合物的新技術得到了較大的開展。組合生物合成的根本原理組合生物合成是建立在天然產物生物合成的根底之上的。聚酮合酶的結構與組成〔1〕聚酮類化合物從結構上分芳香族、大環(huán)內酯類、多烯類、聚醚類和安莎類，具有重要的生物活性，包括抗細菌、抗結核、抗真菌、抗腫瘤、抗病毒、抗蟲以及免疫抑制作用?！?〕它們均以低級脂肪酸為起始單位，由聚酮合酶催化，經過類似于脂肪酸合成的碳鏈B氧化過程，再經過環(huán)化和環(huán)化后的修飾而形成的?！?〕PKSI為模塊式結構，含有多拷貝的活性位點，催化大環(huán)內酯類、聚醚類、多烯類及安莎類的生物合成；PKSII有與PKSI類似的活性位點，但是分散在幾個較小的單功能的多肽上，催化柔紅霉素等芳香族化合物的生物合成。每個單元至少含有B-酮?；蝓ズ铣擅?KS)、?；D移酶(AT)、?；d體蛋白域(ACP)，某些單元中至少還有特異性組合的酮基復原酶(KR)、脫水酶(DH)、烯醇復原酶(ER)和硫酯酶(TE)。DEBS3的C端有TE域參與14碳鏈聚酮體的完成及環(huán)化，形成6-脫氧內酯。由編碼PKS的3個閱讀密碼框架組成，它們是KS、ACP和CLF，在生物合成芳香族化合物中它們重復被使用。此外還含有KR、芳香化酶、環(huán)化酶的參與。二、聚酮合酶結構的特異性和專一性DEBS1單獨或以DEBS1C端局部ACP與DEBS3單元6中的ACP6和TE融合構建DEBS1+TE，均能在Scoelicolor中表達產生三酮體〔1和2〕。在Scoelicolor中也可以乙酸為起始單位形成化合物2。DEBS3在Scoelicolor中表達化合物3。DEBS1+單元3+TE的系統(tǒng)在Scoelicolor中可表達形成化合物4和5。將單元6中ACP6與單元5中KR5融合+TE，去掉單元6，可形成12環(huán)的大環(huán)內酯化合物6。三、聚酮多酶體系的特異性1起始單位底物特異性DEBS的AT-ACP荷載域對底物的特異性有較大的寬容性，如果將整個ATL或ATL-ACPL域去掉，仍能產生6-dEB和衍生的紅霉素，利用這一特點，可以改變起始單位以合成不同的衍生物，如以阿維菌素合成的起始單位異丁酸或2-甲基丁酸可以合成新的三酮體，同樣將阿維菌素ATL-ACPL域替代紅霉素的AT-ACP可以產生以異丁酸或2-甲基丁酸為起始物的紅霉素衍生物。2聚酮鏈延伸單位的底物特異性APKS單元中AT底物特異性PKS單元中各個AT域對底物有相當嚴格的結構和立體構型的要求，僅識別〔2S〕-甲基丙二酰CoA，成為聚酮體合成的守門員，控制聚酮鏈延伸單位的合成。利用AT域對底物的特異性可以在不同抗生素生產菌的PKS中進行互換、替代產生新的化合物，如用帕雷霉素PKS中識別丙二酰CoA底物的AT2替代紅霉素DEBS1+TE系統(tǒng)的AT1組成雜合單元1在Scoelicolor中可以產生新的化合物14和15，同樣用雷帕霉素AT14替代DEBSPKSAT1和AT2，在紅霉素產生菌中那么產生系列去甲基紅霉素〔16〕，12-去甲基紅霉素B〔17〕和10-去甲基紅霉素A〔18〕，同樣用雷帕霉素AT2替代DEBSAT6在Scoelicolor中也產生2-去甲基衍生的紅霉內酯〔19，20〕B?；d體蛋白域對底物無特異性C酮基縮合酶的底物特異性將DEBS中KR5或ER4域去掉可以形成5-酮〔21〕和6，7-脫水的6-dEB紅霉內酯衍生物，說明KS6均能接受天然B-羥基-6-酮基底物非復原型B-酮酰基前體。由于DEBSKS2對底物的特異性要求不專一，因此有可能進行前體定向的生物合成。參加正常甲基丙二酰NAC可形成6-dEB，參加二酮體模擬物-NAC甲基丙二酰不同衍生物〔23，24，25〕，在DEBS:〔KS1缺失〕介導下，在Scoelicolor中可形成不同6-dEB。酮基復原酶KR的底物特異性KR域對底物的要求較寬容，它可以接受許多非天然底物。B-酮?；?ACP復原所生的羥基的D-或L-取決于每個KR域所在的性質。在DEBS1+單元3+TE系統(tǒng)如將KR5替代KR2所得三酮體的立體構型是一樣的，但如果用RAPSKR2替代DEBSKR2那么產生3R三酮體化合物。硫酯酶底物特異性DEBS中TE通常在單元6的C末端催化六酮體C-13羥基與?；?ACP硫酯羰基反響，形成成熟的聚酮體14元環(huán)的6-dEB內酯。TE對聚酮體的結構也有一定的寬容性。對于PKSI型多酶體系中單元酶系的研究，使人們在設計基因組合中能夠比較有針對性。一般來講?；D移酶荷載域有較廣的底物寬容性，在此根底上可進行前體定向組合生物合成；延伸單位?；D移酶底物特異性要求嚴格；縮合酶對底物的識別程度與某些功能基團的存在位置有關；酮基復原酶、脫水酶、烯醇復原酶可以接受許多不同于天然的產物；ACP域對天然或非天然的中間體無差異；硫酯酶可以在6至16元環(huán)中起作用，對底物的立體構型有較高要求。四PKS模塊間的相互作用傳統(tǒng)手段的組合生物合成產物的產率往往比較低：基因重組蛋白的穩(wěn)定性基因重組蛋白介導產物的產率化學的構象上游基因重組產生的中間體是否被下游基因單元繼續(xù)后加工等問題

從上述序列可知，在ACP保守域C端和下一單元KS域N端有一段不同的序列，單元間模塊M2和M3、M4和M5為非共價結合，而其他相鄰的兩者之間均為共價結合，連接序列有明顯不同，單元間連接序列較短；上游單元N端和下游單元C端連接序列較長。連接序列在異源基因表達中起重要的作用連接序列可能影響組合生物合成產物的產量〔1〕DEBS基因M5中AT5+苦霉素pikKR5+苦霉素M6+TE產生3mg/mL〔2〕將pikACP5pikKS6之間的198bp片段去掉，化合物產量下降5-7倍第二節(jié)組合生物合成的基因操作通過不同的基因組合操作可以產生新的化合物〔1〕整個單元操作改變聚酮體鏈的長度：去掉特定的PKSI中的結構域的單個ORF可以改變鏈長，利用異源單元可以增加聚酮體的多樣性〔2〕替代菏載域LD改變生物合成起始單位：用異源LD域替代原LD域例：利福霉素產生菌突變體當參加HBA-3-羥基苯甲酸和DHBA-3,5-二羥基苯甲酸,可以合成新的四酮體.雷帕霉素突變株參加脯氨酸可形成雷帕霉素衍生物〔3〕前體定向生物合將DEBS單元1的KS1缺失，KS2可識別新的前體，合成新化合物，由新的前體介導的生物合成稱為前體定向生物合成〔4〕AT域的互換不同的AT域識別不同的延伸單位，相互替代或置換AT域可以產生新的化合物?！?〕B碳鏈延伸域修飾的操作KR、DH、ER的缺失可導致紅霉素衍生物的產生，引入復原域也可形成產物的多樣性?！?〕單元連接序列的操作基因組合生物合成中間體在非天然單元之間傳遞時的可容納性，在單元間及單元內的連接序列進行操作。〔7〕對聚酮體進行后修飾糖苷化聚酮體只有被引入羥基、羰基、雙鍵等結構，與脂肪酸、氨基酸進行?；?，或進行O-、N-、C-甲基化，或聚酮體糖苷化后才具有生物活性例：將合成與四環(huán)素類似結構的聚酮體基因蔟克隆至含有D-橄欖酸基因產生菌S.fradiae，可產生糖苷化的四環(huán)素。將megosamine合成基因簇克隆至紅霉素產生菌，可以產生巨霉素酮酯類化合物對大環(huán)內酯耐藥菌比較有效，C12位羥基化是酮內酯進一步被肼基取代的必要過程〔8〕體外表達系統(tǒng)DEBS1+TE、DEBS1+單元3+TE或DEBS3+TE系統(tǒng)均能在體外合成相應產物，而且可以接受兩種構型的底物形成兩種構型的化合物。組合生物合成的表達系統(tǒng)載體系統(tǒng)其他較新的聚酮類化合物基因簇及進行基因組合生物合成的可能性1埃波霉素基因簇含有9個單元PKS、22個開放閱讀密碼框和1個非核糖體肽合成酶組成用基因突變或缺失可進行埃波霉素的改造，如使2MT域缺失，可以獲得4-單甲基依普希隆。2拉伐他汀基因簇由兩個PKSI型酶、拉伐他汀的九酮體合成酶和二酮體合成酶組成。3海洋微生物中的PKS基因海洋微生物中別離到產生腸菌素和wailupemycin兩種三維結構的聚酮體化合物。非核糖體多肽合成酶類型基因組合生物合成許多具生物活性、分子量較小的多肽的合成是由非核糖體多酶體系介導。NRPS是由四種以上多功能酶組成，包括活化、起始、延伸、終止。NPRS首先將氨基酸活化為腺嘌呤核苷酸，然后將氨基酸縮合至酶的SH基團，再逐步聚合成多肽。最后由硫酯酶環(huán)化和從酶系中將肽鏈釋放。微囊藻素生物合成基因簇由10個ORF組成，6個多功能酶負責前體的摻入，生物合成過程有非通常功能的酶的參與，因而形成一些特殊的結構。組合生物合成存在的問題多酶體中經組合的前一酶系所產生的中間體有時不能被下一酶系所接受，影響了終產物的形成。宿主的限制修飾系統(tǒng)產物的后修飾需要綜合考慮基因組合改變原來酶系對底物的特異性和對新產物后修飾酶的可塑性生物學與化學的有機組合鏈霉菌的基因轉化系統(tǒng)尚未成熟開展體外蛋白系統(tǒng)廣泛的開發(fā)基因資源第七章胡蘿卜素的生物合成胡蘿卜素生物合成的基因工程胡蘿卜類色素廣泛分布于藻類、植物和一些細菌包括藍細菌，結構的胡蘿卜素已經超過600多個，其主要用途是作為維生素A的營養(yǎng)源、動物飼料色素、化裝品等，同時也發(fā)現(xiàn)具有抑癌活力和防止慢性疾病功能。生物合成途徑的基因和酶迄今為止，已經有150個以上的基因，編碼24個不同crt酶已從細菌、植物、藻類和真菌別離。利用已經克隆出來的合成基因可以在重組微生物中構建一系列的胡蘿卜素。為了擴大結構不同的胡蘿卜素，將不同的合成基因進行組合后在E.coli中進行表達將合成胡蘿卜素前體